現(xiàn)代數(shù)字檢測(cè)儀器對(duì)于western blotting不僅僅是檢測(cè)“有或沒(méi)有”的技術(shù)，還可以進(jìn)行western blotting重復(fù)性和定量的檢測(cè)。 在檢測(cè)方法的線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以控制蛋白上樣量和膜轉(zhuǎn)印帶來(lái)的變化，可以獲得真正的定量結(jié)果。 但是，對(duì)蛋白印跡進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的最佳方法是什么？ 過(guò)去，金標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)化方法是使用看家蛋白，基于這些蛋白在不同實(shí)驗(yàn)條件下和細(xì)胞系中表達(dá)一致的假設(shè)。 然而，最近的研究表明，這種假設(shè)并不總是正確的，導(dǎo)致相對(duì)蛋白豐度的測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)確。 相反，定量Western blotting專(zhuān)家和他們發(fā)表的期刊正在推薦一種新的金標(biāo)準(zhǔn)用于標(biāo)準(zhǔn)化 - 通過(guò)在膜上染色，檢測(cè)每個(gè)泳道的總蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析。

Western blot標(biāo)準(zhǔn)化：看家蛋白和總蛋白

使用看家蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化

使用看家蛋白最大缺點(diǎn)是在樣品間和不同條件下表達(dá)水平可能不一致。如使用看家蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，必須先花費(fèi)時(shí)間和精力來(lái)驗(yàn)證蛋白的選擇，并且可能需要檢查多種潛在的標(biāo)準(zhǔn)品，然后才能找到一種在所有樣品中真正表達(dá)同一水平，并且在不同實(shí)驗(yàn)條件下不會(huì)發(fā)生變化的標(biāo)準(zhǔn)品。

使用看家蛋白的第二個(gè)重大挑戰(zhàn)是它們的表達(dá)豐度很高，如果樣品中的看家蛋白表達(dá)非常高，這會(huì)限制在凝膠上加載的樣品量，因?yàn)樾枰�保留看家蛋白在線(xiàn)性檢測(cè)范圍內(nèi)并且不會(huì)使看家蛋白的信號(hào)飽和。 如果感興趣的蛋白不是同樣高度表達(dá)，這兩種蛋白質(zhì)不在同一線(xiàn)性檢測(cè)范圍內(nèi)。

如果您正在進(jìn)行多重蛋白印跡，例如比較同一蛋白質(zhì)的磷酸化和非磷酸化形式，則需要考慮的第三個(gè)挑戰(zhàn)是從不同物種中產(chǎn)生一抗和二抗的復(fù)雜性。

最后，檢測(cè)的看家蛋白可能干擾感興趣蛋白的檢測(cè)。理想情況下，看家蛋白應(yīng)該與感興趣蛋白的大小不同，因此這兩種蛋白可在印跡上空間分辨。 當(dāng)實(shí)驗(yàn)在同一印跡上檢查多種目的蛋白時(shí)，這變得越來(lái)越困難。

圖1.與常見(jiàn)的看家蛋白相比，AzureRed具有更寬的線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍

單色通道圖像A）AureRed染色總蛋白B）Tubulin C）β-action和D）GAPDH。 AzureRed信號(hào)的優(yōu)異動(dòng)態(tài)范圍與實(shí)際加載的蛋白量顯示在圖像（A）中。使用AzureSpot軟件定量來(lái)自總蛋白和看家蛋白的信號(hào)，并將得到的值相對(duì)于每個(gè)樣品加載的蛋白量（E）作圖。與常見(jiàn)的看家蛋白相比，AzureRed表現(xiàn)出更強(qiáng)的相關(guān)性和更廣泛的動(dòng)態(tài)范圍。

圖2.使用AzureRed熒光蛋白染色法將tubulin條帶信號(hào)進(jìn)行總蛋白標(biāo)準(zhǔn)化

使用AzureSpot軟件定量tubulin蛋白條帶。原始的tubulin條帶灰度（藍(lán)色直方圖）和總蛋白標(biāo)準(zhǔn)化的條帶灰度（橙色直方圖）。使用AzureRed標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)可校正上樣誤差或膜轉(zhuǎn)印所產(chǎn)生的差異。

使用總蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化

使用總蛋白標(biāo)準(zhǔn)化，不是試圖找到可以代表轉(zhuǎn)移到膜上的樣品總量的蛋白，而是直接在膜上測(cè)量總蛋白，并且該值在標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)用作分母。許多總蛋白染色劑可用于染色凝膠和膜�？偟鞍兹旧�提供更寬的動(dòng)態(tài)范圍，并且表現(xiàn)出比看家蛋白更低的可變性和更清楚的數(shù)據(jù)。

總蛋白標(biāo)準(zhǔn)化比使用看家蛋白質(zhì)快得多，特別是對(duì)于化學(xué)發(fā)光印跡，因?yàn)橄鄬?duì)于剝離和重孵育染色步驟花費(fèi)較少的時(shí)間。 理想情況下，在免疫檢測(cè)之前或之后，在膜上進(jìn)行總蛋白染色。使用一些染色劑如AzureRed Fluorescent Total Protein Stain，可以在免疫檢測(cè)前對(duì)印跡進(jìn)行染色，然后與目的蛋白同時(shí)對(duì)總蛋白進(jìn)行成像(S)。 通過(guò)這種最簡(jiǎn)單的工作流程，目的蛋白和總蛋白的圖像會(huì)自動(dòng)對(duì)齊。

與使用看家蛋白相比，圖像捕獲后的分析工作流程基本不變; 整個(gè)泳道或泳道中大部分信號(hào)用于標(biāo)準(zhǔn)化，而不是單一的條帶。

用總蛋白染色劑對(duì)膜進(jìn)行染色提供了額外的質(zhì)控優(yōu)勢(shì)，可以驗(yàn)證轉(zhuǎn)印是否完全。

Azure Biosystems™的Sapphire™NIR-Q多功能激光生物分子成像系統(tǒng)具有兩個(gè)用于近紅外熒光檢測(cè)（700nm和800nm）的通道和用于檢測(cè)總蛋白專(zhuān)用的第三通道，使多重Western blotting標(biāo)準(zhǔn)化變得輕而易舉。

您可以繼續(xù)使用相同的NIR染料，同時(shí)加入總蛋白質(zhì)染色劑，例如我們的低背景和易于使用的AzureRed試劑。 無(wú)需剝離和重孵育能夠檢測(cè)兩種不同的蛋白和總蛋白信號(hào)。

> 定量更準(zhǔn)確

> 檢測(cè)更靈活

> 平臺(tái)設(shè)計(jì)更靈活

> 模塊化設(shè)計(jì)