1.前言

循環(huán)游離核酸(circulating cell-free nucleic acids)是指存在于人體循環(huán)系統(tǒng)中，游離于細(xì)胞外的微量?jī)?nèi)源性或外源性核酸片段，包括核DNA、線粒體DNA(mitochondrial DNA，mitDNA)、病毒DNA、信使RNA(messenger RNA， mRNA)及微小RNA(microRNA， miRNA)等。 1948年， Mandel等［1］ 首次發(fā)現(xiàn)了血液循環(huán)中游離DNA的存在。隨后，循環(huán)游離核酸在病理狀態(tài)下的特異性變化引起了廣泛關(guān)注。雖然這一發(fā)現(xiàn)十分重大，但當(dāng)時(shí)并未引起人們的廣泛關(guān)注，并且在此后的很長(zhǎng)一段時(shí)間里，人們也僅局限于研究游離 DNA 與人類自身免疫病之間的關(guān)系。 1975 年， Steinman 在健康人的血漿中也發(fā)現(xiàn)有游離形式的核酸存在，這提示我們這種核酸的出現(xiàn)屬于病理學(xué)事件，而非病因?qū)W事件，但健康人血漿中游離 DNA 的量要顯著低于患有一定疾病的人。 1977年， Leon等［2］ 發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清中的游離DNA水平較健康人群明顯升高，并與腫瘤的進(jìn)展與預(yù)后相關(guān)。 1997年，人們發(fā)現(xiàn)在孕婦血漿中含有游離形式的胎兒源的 DNA，這使得血漿游離核酸的研究在胎兒出生前診斷方面的應(yīng)用也有了快速的發(fā)展。 1989年， Stroun等［3］ 發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血液中的游離核酸含有與腫瘤細(xì)胞相同的基因突變�，F(xiàn)如今，游離核酸與腫瘤、妊娠相關(guān)性疾病、自身免疫病、移植排斥反應(yīng)、創(chuàng)傷、急救醫(yī)學(xué)等有著密切關(guān)系，其檢測(cè)對(duì)疾病的早期診斷、分期、監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷等有重要意義。

鑒于游離核酸的重要檢測(cè)意義，游離核酸的保存條件則直接決定了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。為確保游離核酸標(biāo)本檢測(cè)的準(zhǔn)確性， 本文采用了市面上常用的不同品牌游離核酸保存管，就保存效果進(jìn)行了比較。

2 材料與方法

2. 1 材料

2.1.1 保存管及分組
（1） E 組：普通抗凝采血管（主要成分 EDTA·2Na）；
（2） S 組： Cell-Free DNA BCT（品牌： S 公司， REF.2***52）；
（3） B 組： Cell-Free DNA Storage Tube 10mL(品牌：百泰克， REF. ST2001)；
（4） K 組： Cell-Free DNA Storage Tube 10mL（品牌： K 公司， Cat. CW***6S）。2.1.2 血液樣本
健康人血 10ml。

2.1.3 試劑及設(shè)備
（1） Premix EX Taq （TaKaRa,Cat.RR390A）；
（2）探針及引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；
（3） Qubit dsDNA HS Assay Kit（Invitrogen by Thermo Fisher Scientific）；
（4） Beta-actin 質(zhì)粒由上海捷瑞生物工程有限公司合成；
（5） BioRad-CFX96(BIO-RAD, Foster city, California， USA）， Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies， USA)， Mili-Q Advantage A10， SHZ-82A 恒溫振蕩器（常州醫(yī)療器件廠） 。

2.2 方法

2.2.1 血液樣本采集
采用標(biāo)準(zhǔn)靜脈穿刺采集年齡 22-40 歲健康人血 10ml，各組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05） ，分別裝于采血管及保存管。

2.2.2 血漿分離方法
輕柔上下顛倒混勻 10 次， 800×g， 20min，轉(zhuǎn)移上層血漿至 1.5ml 離心管； 16,000×g，室溫， 10min，轉(zhuǎn)移上層血漿至 1.5ml 離心管凍存-80℃?zhèn)溆�。提取游離核酸前，室溫解凍，16,000×g， 5min，吸取上層血漿，進(jìn)行游離核酸提取。

2.2.3 游離核酸提取方法
根據(jù) QIAamp Circulating Nucleic Acid Handbook 試劑盒操作說明操作。

2.2.4 Qubit 熒光計(jì)定量血漿游離 DNA 的濃度
采用 Qubit 2.0 熒光計(jì)定量血漿游離 DNA 的濃度。

2.2.5 Beta-actin 拷貝數(shù)的檢測(cè)
Beta-actin 10 倍梯度稀釋 107-101，引物分別分 actin-F1， actin-R1，探針為 probe actin，引物及探針工作濃度為 5 uM， 20ul 熒光定量體系引物加入量為各 1ul。擴(kuò)增程序?yàn)?50° C、 5min， 95° C、 10min，循環(huán) 50 次， 95° C、 20s， 65° C、 20s，72° C、 10min， 結(jié)束。

擴(kuò)增程序試劑組成：
Reagent         體積（ul）
Takara Premix      10
Primer F         1
Primer R         1
Probe           1
模板           1
ddH2O          補(bǔ)足 20ul

3 結(jié)果

3.1 不同天數(shù)下（25°C）游離核酸保存效果的對(duì)比

分別用 3 種不同的保存管（E、 S 及 B）采集血液 10ml，顛倒混勻 15 次后立即等分 4份至無(wú)抗凝劑無(wú)促凝劑的玻璃采血管中，保存條件為 25°C。分別于保存第 0、 3、 7、 14 天時(shí)分離血漿，提取游離核酸。

圖 1 顯示： 保存第 7 天和第 14 天， E 組出現(xiàn)明顯的溶血現(xiàn)象，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)更加嚴(yán)重；S 品牌產(chǎn)品保存的血液第 7 天略微有溶血現(xiàn)象，第 14 天時(shí)，溶血嚴(yán)重。相比之下， B 品牌產(chǎn)品效果較佳。

圖2 顯示： 25°C條件下， E產(chǎn)品在第0天時(shí)，基因組基本無(wú)釋放； 第3、 7、 14天的核酸量隨時(shí)間延長(zhǎng)，基因組釋放量增加明顯； 第14天的核酸檢測(cè)量是第0天的至少2500倍。 B產(chǎn)品的保存效果在14天之內(nèi)，基本能夠抑制基因組的釋放； 第14天的檢測(cè)結(jié)果為第0天的1.77倍。 S品牌產(chǎn)品7天之內(nèi)，能夠保持cfDNA穩(wěn)定，基本無(wú)基因組釋放；但第14天檢測(cè)量劇增，是第0天的2200倍。

圖 3 顯示： Beta-actin 絕對(duì)定量結(jié)果趨勢(shì)與 Qubit 結(jié)果基本一致，室溫 25°C 保存 3 天， 3 種保存管的差異不顯著；保存第 7 天時(shí)， E 與 B 組間的 P Value<0.01， 差異極顯著， B 與 S 組 0.01

圖 4Qubit 結(jié)果顯示： 三種保存管 7 天內(nèi)保存效果無(wú)明顯差異， 14 天時(shí)， K 組與 S 組保存管均出現(xiàn)明顯的上升，分別是第 0 天的 15.27 倍和 10.21 倍， 21 天時(shí)，上升最為明顯，分別是第 0天的 22.46 倍和 13.84 倍。 B 組保護(hù)劑保存的血液在第 0、 3、 7、 14、 21、 28 天檢測(cè)時(shí)， 每毫升血液 cf-DNA 濃度均無(wú)明顯的上升。

圖 5Beta-actin 絕對(duì)定量結(jié)果與圖 4 基本一致。 B2 組保護(hù)劑保存的血液在第 0、 3、 7、 14、21、 28 天檢測(cè)時(shí)， 每毫升血液 Beta-actin 拷貝數(shù)均無(wú)明顯的上升。

3.2 不同天數(shù)下（4°C）游離核酸保存效果的對(duì)比

圖 6Qubit 結(jié)果顯示： 在 4°C 情況下， 三種保存管 0-14 天的每毫升血液 cf-DNA 濃度并無(wú)明顯的差異。

圖 7Beta-actin 結(jié)果顯示：在 4°C 情況下，三種保存管 0-14 天的每毫升血液 Beta-actin 拷貝數(shù)并無(wú)明顯的差異。

3.3 不同天數(shù)下（37°C）游離核酸保存效果的對(duì)比

圖 8Qubit 結(jié)果顯示：在 37°C 情況下，三種保存管 0-14 天的每毫升血液 cf-DNA 濃度并無(wú)明顯的差異。

圖 9Beta-actin 結(jié)果顯示：在 37°C 情況下，三種保存管 0-14 天的每毫升血液 Beta-actin拷貝數(shù)并無(wú)明顯的差異。

3.4 運(yùn)輸環(huán)境（25°C）對(duì)游離核酸保存效果的影響

考慮到保存管有可能應(yīng)用于樣品的長(zhǎng)途或短途運(yùn)輸，因此需用搖床模擬運(yùn)輸環(huán)境對(duì)保護(hù)劑抑制細(xì)胞破裂的影響。 S 組、 K 組及 B 組分別采集血液一份，搖床設(shè)置 180rpm， 25°C，分別在 0、 3、 7、 14 天檢測(cè)核酸濃度和 beta-actin 拷貝量。

圖 10Qubit 結(jié)果顯示：在 25°C 模擬震蕩情況下，三種保存管 0-14 天的每毫升血液 cf-DNA濃度并無(wú)明顯的差異。

圖 11Beta-actin 結(jié)果顯示：在 25°C 模擬震蕩情況下，三種保存管 0-14 天的每毫升血液Beta-actin 拷貝數(shù)并無(wú)明顯的差異。

4.討論

（1）從每毫升血液 Beta-actin拷貝數(shù)及每毫升血液 cf-DNA濃度兩個(gè)方面來(lái)驗(yàn)證 cf-DNA完整性，已在多篇文獻(xiàn)中[4][5]得到驗(yàn)證。
（2） 室溫 25°C 下，保存 3 天時(shí)， 3 種保存管的差異不顯著；保存第 7 天時(shí)， E 與 B 組間的差異極顯著， B 與 S 組差異具有顯著性；保存第 14 天時(shí)， B 與 S 組 P value<0.01，差異極顯著。 在室溫 25°C 下， B 組較 S 組及 E 組，保存時(shí)間較長(zhǎng)，效果較佳。
（3）室溫 25°C 下，三種保存管 7 天內(nèi)保存效果無(wú)明顯差異， 14 天時(shí)， K 組與 S 組保存管均出現(xiàn)明顯的上升，， 21 天時(shí)，上升最明顯。 B 組保護(hù)劑保存的血液在第 0、 3、 7、 14、 21、 28 天檢測(cè)時(shí)，每毫升血液 cf-DNA 濃度均無(wú)明顯的上升。 在室溫 25°C 下， B 組較 S 組及 K 組，保存時(shí)間較長(zhǎng)，效果較佳。
（4）在 4°C 情況下，三種保存管 0-14 天的每毫升血液 Beta-actin 拷貝數(shù)及每毫升血液 cf-DNA濃度并無(wú)明顯的差異。 在 4°C 下， B 組、 S 組及 K 組，保存效果無(wú)明顯差異。
（5）在 37°C 情況下，三種保存管 0-14 天的每毫升血液 Beta-actin 拷貝數(shù)及每毫升血液 cf-DNA濃度并無(wú)明顯的差異。 在 37°C 下， B 組、 S 組及 K 組，保存效果無(wú)明顯差異。
（6） 在 25°C 模擬震蕩情況下，三種保存管 0-14 天的每毫升血液 Beta-actin 拷貝數(shù)及每毫升血液cf-DNA 濃度并無(wú)明顯的差異。 在 25°C 模擬震蕩情況下， B 組、 S 組及 K 組，保存效果無(wú)明顯差異。

5.參考文獻(xiàn)

[1]MANDEL P, MéTAIS P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l’homme ［J］ . C R Acad Sci Paris, 1948,142: 241-243.
[2]LEON S A, SHAPIRO B, SKLAROFF D M, et al. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy ［J］ .Cancer Res, 1977, 37(3): 646-750.
[3]STROUN M, ANKER P, MAURICE P, et al. Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients［J］ . Oncology, 1989, 46(5): 318-322.
[4]Norton S E, Lechner J M, Williams T, et al. A stabilizing reagent prevents cell-free DNA contamination by cellular DNA in plasma during blood sample storage and shipping as determined by digital PCR[J]. Clinical Biochemistry, 2013, 46(15):1561-5.
[5] Ryan W L, Fernando R M, Das K. BLOOD COLLECTION DEVICE FOR STABILIZING CELL-FREE PLASMA DNA:, WO 2013123030 A3[P]. 2013.