通告：今日起，原“imOmics精華速遞”改版為“旭月活體研究通訊”，簡稱“旭月通訊”，每周一期。除介紹最新的NMT文獻(xiàn)外，還有實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、設(shè)備操作、數(shù)據(jù)分析、文章撰寫、審稿答疑......更多干貨，等你來撩。

NISC文獻(xiàn)編號(hào)：C2015-036

研究使用設(shè)備

NMT活體生理檢測儀 NMT  Physiolyzer^®

硝酸鹽是谷類作物主要的氮源，因此掌握谷物的硝酸鹽信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對于提高其氮利用效率至關(guān)重要。盡管已經(jīng)在擬南芥中鑒定出了幾個(gè)硝酸鹽信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子，但在谷物中并未發(fā)現(xiàn)。

 

中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所童依平課題組在Plant Physiology上發(fā)表了一篇文章，題為“The Nitrate-Inducible NAC Transcription Factor TaNAC2-5A ControlsNitrate Response and Increases Wheat Yield”，主要探究谷物中硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)。

野生型與過表達(dá)型玉米，在高低氮條件下根部NO₃^-流檢測。正值表示吸收。

 

課題組從小麥中分離到一種硝基誘導(dǎo)的谷類特異NAM，ATAF和CUC(NAC)轉(zhuǎn)錄因子TaNAC2-5A。染色質(zhì)免疫沉淀試驗(yàn)表明：TaNAC2-5A可直接與硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和谷氨酰胺合成酶編碼基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。小麥中TaNAC2-5A過表達(dá)促進(jìn)根的生長以及硝酸鹽吸收速率，從而提高根系吸收氮素的能力。

 

研究利用基于非損傷微測技術(shù)（Non-invasive Micro-testTechnology, NMT）的NMT活體生理檢測儀 Physiolyzer®，檢測根部NO₃^-流，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因型植物根部的NO₃^-吸收速率顯著高于野生型，這為TaNAC2-5A促進(jìn)作物根部NO₃^-吸收提供了最直接的生理證據(jù)。

2018年6月4日，旭月研究院前往中科院遺傳所開展了非損傷微測技術(shù)應(yīng)用培訓(xùn)�，F(xiàn)場的老師同學(xué)，就非損傷檢測植物鉀營養(yǎng)吸收，提出了具有代表性的幾個(gè)問題。

 

 

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一、為什么測不到鉀營養(yǎng)吸收

1. 饑餓處理

·氮（N）、鉀（K）等營養(yǎng)吸收實(shí)驗(yàn)的首要關(guān)注點(diǎn)。N饑餓、K饑餓的時(shí)間，參考文獻(xiàn)，一般為2-7天（C2014-022，想要文獻(xiàn)全文，請?jiān)诘撞苛粞阅�的郵箱及文獻(xiàn)編號(hào)）。

 

·有的老師可能不愿接受饑餓處理，認(rèn)為對其實(shí)驗(yàn)來說，又多了一個(gè)脅迫因素“饑餓脅迫”。當(dāng)然，從嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕嵌瘸霭l(fā)，在可以接受的工作量前提下，您可以同時(shí)設(shè)置饑餓、非饑餓組，都進(jìn)行嘗試。

 

我要說的是，在NMT沒有出現(xiàn)前，植物對N、K吸收的證據(jù)，主要來自于N、K含量的測定，例如ICP-MS或同位素質(zhì)譜，這些檢測手段都不是實(shí)時(shí)檢測，而屬于“終點(diǎn)法”，即檢測一個(gè)“起點(diǎn)”值，再檢測一個(gè)“終點(diǎn)”值，二者之差，即為植物對N、K吸收的量。但事實(shí)上，NMT出現(xiàn)后，檢測發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)元素并非每時(shí)每刻都處于吸收的狀態(tài)（NMT是實(shí)時(shí)監(jiān)測），而且對植物根來說，也并不是每個(gè)部位都會(huì)吸收（NMT是微米級(jí)精確定點(diǎn)檢測）。受傳統(tǒng)技術(shù)影響，需要給廣大的研究者一定的時(shí)間空間，接受這些新的結(jié)果。NMT發(fā)現(xiàn)植物對N、K的實(shí)時(shí)吸收信號(hào)很微弱，所以需要通過通過“饑餓”等手段，來放大這一過程，以便觀察各組間的信號(hào)差異。

 

2. 苗齡

·離子流的變化，在植物生理上屬于早期事件，也就是樣品在宏觀上還沒有差異的時(shí)候，離子流已經(jīng)開始發(fā)生變化。反之，宏觀上已經(jīng)可以察覺到變化時(shí)，離子流的差異可能無法檢測到了。所以常規(guī)的實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)，與離子流的時(shí)間點(diǎn)，會(huì)有時(shí)間差，一般離子流檢測相比于常規(guī)實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)，都要靠前。

 

·根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，擬南芥（C2011-003）、水稻（C2014-022）、小麥、番茄等草本植物，大小一般都是3周內(nèi)。如果太大，例如超過一個(gè)月，離子流信號(hào)可能就很弱了。

 

·特別要注意，有的老師會(huì)告訴我，用其它方法（ICP-MS）檢測發(fā)現(xiàn)，苗大小為30天時(shí)，可以看到鉀含量差異，或者直接告訴我希望同前期的其它實(shí)驗(yàn)條件保持一致（其它實(shí)驗(yàn)都有用30天的苗）。您可以去嘗試，但是我為什么不建議您用太大的苗，原因參考上文。

 

3.檢測液濃度

據(jù)經(jīng)驗(yàn)，在很多情況下，高K環(huán)境會(huì)抑制根對K的吸收。所以檢測液中的K濃度，一般設(shè)置為0.1 mM~0.5 mM。但是有些實(shí)驗(yàn)要求在不同的K濃度下檢測，則可自行設(shè)置。

 

4.檢測位點(diǎn)

在“饑餓處理”中，我們已經(jīng)提到，植物根部并非每個(gè)部位都會(huì)吸收K，參考文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，有的是距離根尖100 μm處的分生區(qū)，有明顯K吸收（C2011-003）；還的是距離根尖1.4 cm處的成熟區(qū)（C2014-024）。所以您在實(shí)驗(yàn)的最開始，需要通過對自己樣品根部各區(qū)域進(jìn)行掃描檢測（簡稱“掃根”），最終確定K吸收信號(hào)最明顯的位點(diǎn)，繼而定點(diǎn)檢測。

楊樹根部NH₄⁺、NO₃^-掃根結(jié)果（C2014-025）

 

 

二、檢測K⁺時(shí)信號(hào)波動(dòng)大

 

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1. 檢測前讓樣品在檢測液中“待”一會(huì)

解決方案：實(shí)驗(yàn)的前幾個(gè)樣品多測一會(huì)，摸索穩(wěn)定所需時(shí)間（平衡階段）。

 

樣品從培養(yǎng)液中，進(jìn)入到檢測液里，也需要適應(yīng)。所以讓樣品在檢測液中“待”一會(huì)，可能是5分鐘或10分鐘，然后再上樣檢測。這樣，就可以排除前期環(huán)境變化導(dǎo)致的信號(hào)波動(dòng)的影響了。具體原因可觀看視頻《NMT實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及作圖培訓(xùn)》。

 

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2. 波動(dòng)信號(hào)可能是重要發(fā)現(xiàn)

請參考現(xiàn)代非損傷微測技術(shù)聯(lián)合創(chuàng)始人許越的博文《飄忽不定的諾貝爾獎(jiǎng)機(jī)遇：如何理解和用好NMT數(shù)據(jù)？》

這是一位老師和旭月工程師在檢測間隙，一起出去吃午飯時(shí)，無意中記錄下的數(shù)據(jù)�？闯鲇惺裁匆�(guī)律嗎（黃線部分是他們吃飯前記錄到的）？

 

三、審稿人質(zhì)疑K⁺傳感器測到的到底是不是K⁺

 

現(xiàn)代非損傷微測技術(shù)聯(lián)合創(chuàng)始人許越，教您如何應(yīng)對審稿人的質(zhì)疑《如何確定NMT測到的就是K⁺流|審稿人疑問解答》

 

截止2018年5月份，國內(nèi)學(xué)者發(fā)表的NMT相關(guān)SCI文章共216篇，總影響因子為846.033。

 

注：SIET、MIFE、SVET、SPET等技術(shù)名稱，已經(jīng)統(tǒng)一為Non-invasive Micro-test Technology，中文名“非損傷微測技術(shù)”，簡稱NMT。

 

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