穩(wěn)轉(zhuǎn)株即穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，指的是基于某一細(xì)胞系構(gòu)建的持續(xù)過表達(dá)或干擾某特定基因的細(xì)胞系。慢病毒感染-藥物篩選法是目前廣泛應(yīng)用的穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建方法，具有高效整合、目標(biāo)細(xì)胞廣泛等特點(diǎn)。

一．準(zhǔn)備及預(yù)實(shí)驗(yàn)

• 確定細(xì)胞系相關(guān)信息，需包括如下內(nèi)容

目標(biāo)細(xì)胞系培養(yǎng)條件

目標(biāo)細(xì)胞增殖速度

支原體污染情況

注：為避免慢病毒感染后細(xì)胞死亡，務(wù)必保證細(xì)胞無支原體污染！ 

• 預(yù)實(shí)驗(yàn)確定MOI值

• 查閱文獻(xiàn)確定慢病毒在目標(biāo)細(xì)胞系中的MOI；
• 參考查閱得到的數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)梯度實(shí)驗(yàn)，摸索最適MOI。

• 預(yù)實(shí)驗(yàn)確定篩選藥物用量：

• 查閱Puromycin/Blastincidin等在目標(biāo)細(xì)胞系中穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選的致死用量信息；
• 參考查閱得到的數(shù)據(jù)，確定3個(gè)藥物濃度梯度（如沒有相關(guān)信息，則需將藥物濃度梯度范圍增大，數(shù)量增多至6個(gè)）；
• Day0將細(xì)胞鋪于6孔板中，使Day1細(xì)胞融合度約90%；
• Day1按（2）中設(shè)置的藥物梯度，加入藥物；
• Day4換液，并重新加入藥物； 
• Day7觀察，找到致死率100%的孔，該孔使用的藥物濃度，即為藥物篩選濃度。

附1：經(jīng)驗(yàn)篩選藥物用量

 

二．穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選及構(gòu)建

注：以下實(shí)驗(yàn)參數(shù)，按1株穩(wěn)轉(zhuǎn)株為例描述，實(shí)驗(yàn)需考慮有無對(duì)照穩(wěn)轉(zhuǎn)株！

• 細(xì)胞鋪板：

將細(xì)胞接種于6孔板中（4個(gè)孔），使次日細(xì)胞融合度約70%

• 病毒感染：

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的MOI值，計(jì)算慢病毒體積，添加慢病毒（每孔添加ADV-HR 2μL）；

• 換液：

慢病毒感染次日，將細(xì)胞進(jìn)行換液處理；

• 觀察感染效率：

感染后72小時(shí)，觀察感染效率，效率最低不應(yīng)低于40%。

• 篩選：

• 多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株：從感染72小時(shí)后開始于6孔板中加篩選藥物，每隔2天，重新?lián)Q液加入藥物。藥物篩選需至少持續(xù)14天，直至顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞比例為100%。

注：第一次加入藥物時(shí)在上午進(jìn)行，4-6小時(shí)后觀察細(xì)胞狀態(tài)，如細(xì)胞死亡過多，需更換新鮮不含藥物的培養(yǎng)基。

附2：多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株

 

多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株的熒光通常強(qiáng)弱夾雜。

 

• 單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株：建立在獲得多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株基礎(chǔ)上

• 有限稀釋法：

 

 

• 取24個(gè)1.5毫升EP管，每管中加入800微升完全培養(yǎng)基；

用胰酶將多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株消化（90%融合度，10毫升培養(yǎng)基終止消化），取80微升至第一個(gè)EP管中，混合均勻；

注：應(yīng)使用1000微升槍尖，混合時(shí)不要過度吸打，以免破壞細(xì)胞。

• 從第一個(gè)EP管中取80微升至第二個(gè)EP管中，混合均勻，以此類推。
• 將EP管中的細(xì)胞懸液，以每孔100微升，接種于96孔板中；
• 過夜培養(yǎng)后，觀察第12-24列，尋找只含有1個(gè)細(xì)胞的孔，并做好標(biāo)記；
• 培養(yǎng)3-4周，待標(biāo)記孔中細(xì)胞擴(kuò)增后，消化傳代擴(kuò)增，即為單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞。

注：培養(yǎng)的第一周不要換液，接下來每3-4天換液。

• 平板挑取法

 

• 計(jì)數(shù)100個(gè)多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞，接種于一個(gè)10cm培養(yǎng)盤中；

注：盡量吹打均勻，防止細(xì)胞聚團(tuán)。

• 過夜培養(yǎng)后，觀察并尋找單個(gè)細(xì)胞的位置，并在盤底做標(biāo)記；
• 培養(yǎng)培養(yǎng)2周；

注：培養(yǎng)的第一周不要換液，接下來每3-4天換液。

• 待標(biāo)記處的細(xì)胞擴(kuò)增為肉眼可見的白點(diǎn)，在移液器尖端吸取一點(diǎn)胰酶，緩慢滴至細(xì)胞處，待細(xì)胞消化后，迅速吹打，將消化下的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板中，傳代擴(kuò)增，即為單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞。約需2-3周的時(shí)間。

注：每盤選取20個(gè)為宜，在消化時(shí)，需按照先消化邊緣的，再消化中心的原則，防止克隆之間的相互污染。培養(yǎng)的第一周不要換液，接下來每3-4天換液。

附3：?jiǎn)慰寺》�(wěn)轉(zhuǎn)株

 

單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株的熒光強(qiáng)度基本一致。

 

三、穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建中的常見問題

1.支原體污染問題

由于輕度的支原體污染并不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，故被許多實(shí)驗(yàn)室所忽略。但支原體易在病毒感染細(xì)胞后爆發(fā)，出現(xiàn)大量細(xì)胞碎片，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，導(dǎo)致穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選的失敗。我們建議在穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建之初，務(wù)必排除細(xì)胞及培養(yǎng)環(huán)境中的支原體污染。

2. 其他問題

除支原體污染之外，還有以下問題會(huì)經(jīng)常出現(xiàn)于穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建中。