一、自噬簡介

     

       1、大自噬（macroautophagy），也就是通常說的自噬（autophagy），是真核細胞蛋白降解的途徑之一。自噬可以被描述為細胞質(zhì)內(nèi)的成分（細胞器、蛋白等）被雙層膜的囊泡包裹，形成自噬體（autophagosome），進而傳遞到溶酶體進行降解的過程。

      詳細來說，自噬過程與內(nèi)涵體途徑（endolysosomal pathway）密不可分（見圖1）。一方面，自噬體能夠與晚期內(nèi)體（late endosome）融合形成中間囊泡（amphisome）最終形成自噬溶酶體（autolysosome）；另一方面，自噬體能夠直接與溶酶體（lysosome）融合形成自噬溶酶體。無論通過哪條途徑，自噬溶酶體最終通過酸性水解酶將細胞器、蛋白等消化分解。

      細胞本底水平的自噬發(fā)生在營養(yǎng)充足的條件下，可保護細胞免受錯誤折疊蛋白或受損細胞器的影響，從而防止某些疾病的發(fā)生（如神經(jīng)退行性疾病和癌癥）。饑餓等也可誘導自噬的發(fā)生，通過降解大分子物質(zhì)和細胞器為細胞活動提供營養(yǎng)和能量。

 

圖1 自噬過程及其與內(nèi)涵體途徑的關(guān)系

(Tom Egil Hansen and Terje Johansen，BMC Biology，2011)

 

2、自噬的調(diào)控

 

      雷帕霉素靶蛋白（mTOR）激酶在自噬反應中起著重要的調(diào)節(jié)作用。mTOR（Akt and MAPK signaling）在被mTOR激酶激活后，自噬反應被抑制；而在mTOR（AMPK and p53 signaling）未被抑制后，自噬反應機制被啟動。作為酵母中Atg1的同系物，三個相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸激酶 UNC-51樣酶-1，-2，-3（ULK1, ULK2, UKL3），通過與mTOR復合物之間的相互作用來實現(xiàn)自噬反應。ULK1、ULK2、mAtg13和骨架蛋白FIP200（酵母Atg17的同系物）一起形成一個復雜的復合物。Class III PI3K復合物由hVps34, Beclin-1 (酵母 Atg6的同系物), p150 (酵母Vps15同系物), 和類Atg14蛋白 (Atg14L or Barkor) 或者紫外線放射抗性相關(guān)蛋白UVRAG (ultraviolet irradiation resistance-associated gene )蛋白組成，其在誘導自噬反應中起關(guān)鍵作用。Atg基因通過形成Atg12-Atg5 and LC3-II (Atg8-II)復合物來調(diào)控自噬體的形成。在Atg7和Atg710（分別對應泛素活化酶E1和泛素結(jié)合酶E2酶）的作用下，Atg12和Atg5之間通過一個類泛素反應結(jié)合形成Atg12-Atg5，Atg12-Atg5再通過非共價鍵與Atg16結(jié)合形成多聚體Atg12-Atg5-Atg16，參與自噬體的擴張。在Atg4、 Atg7和Atg3的作用下，LC3轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-II-PE并緊密結(jié)合于自噬泡膜表面，參與前自噬體的延伸。

 

      自噬既能抑制也能促進細胞凋亡，兩種反應在生物體內(nèi)廣泛存在。在營養(yǎng)缺乏時，自噬反應作為一個細胞的促活反應機制存在，但是過量的自噬反應也會導致細胞死亡，但由自噬導致的細胞死亡與細胞凋亡在形態(tài)學上有明顯的不同。幾種促凋亡信號因子，如TNF, TRAIL, and FADD也會誘導自噬的反應發(fā)生。此外，Bcl-2也是自噬反應重要的調(diào)節(jié)因子，其為凋亡抑制蛋白，通過與Beclin-1結(jié)合形成復合物，來抑制由Beclin-1誘導的細胞自噬。

 

      線粒體自噬屬于選擇性自噬，其主要作用是降解細胞中損傷以及不需要的線粒體。當線粒體損傷之后，在正常的線粒體中持續(xù)被降解的PINK蛋白（PARL促進此反應）會處于穩(wěn)定狀態(tài)，再通過E3連接酶Parkin的作用來誘導線粒體自噬。Parkin會誘導線粒體膜蛋白的聚泛素化，由此導致與LC3結(jié)合的自噬受體蛋白的SQSTM1/p62, NBR1, and Ambra1聚集。此外，在特定的細胞類型中，同樣存在LC3結(jié)合區(qū)域（LIR）的BNIP3 和 BNIP3L/NIX直接通過泛素依賴型反應機制也會聚集自噬反應的相關(guān)因子，進而促進自噬體的形成。

 

3、LC3 

      LC3（light chain 3）簡稱于MAP1LC3 (microtubule-associated proteins light chain 3)，是目前公認的自噬標記物。哺乳動物中的LC3與酵母中的自噬相關(guān)蛋白Apg8/Aut7/Atg8具有同源性。

     LC3蛋白合成后在其羧基端被Atg4剪切，暴露甘氨酸殘基，產(chǎn)生細胞漿定位的LC3-I。在自噬過程中，LC3-I會被包括Atg7和Atg3在內(nèi)的泛素樣體系修飾和加工，與磷脂酰乙醇胺（PE）共價結(jié)合，形成LC3-II并定位于自噬體膜上（見圖3）。哺乳動物中的LC3可分為三種： LC3A、LC3B和LC3C。 其中，LC3B作為LC3的一種，同樣可以用作自噬的分子標志。

 

圖3  LC3在自噬體形成中的作用

(Varuna C. Banduseela et al，Phyciological Genomics，2012)

 

4、自噬流檢測方法

 

      細胞經(jīng)自噬誘導或抑制后，需對自噬流的水平進行觀察和檢測，常用的技術(shù)手段見表1：

 

表1 自噬體計數(shù)及自噬流檢測方法匯總

（Mizushima et al, Cell, 2010）

      其中，電鏡觀察法由于受到實驗條件和設(shè)備的限制應用范圍有限；而由于自噬過程發(fā)生快速，通過IB/WB檢測LC3-II水平和GFP-LC3的方法易受到實驗進行時長的影響。

      想要準確檢測自噬流的變化，需要多種技術(shù)手段共同使用，才能達到理想的實驗效果，產(chǎn)生具有說服性的實驗結(jié)果。

 

自噬雙標產(chǎn)品 ：mCherry-GFP-LC3B腺病毒（Adenovirus）、慢病毒（Lentivirus）和腺相關(guān)病毒（AAV）

  

 mCherry-GFP-LC3B自噬雙標系統(tǒng)的工作原理為： 未發(fā)生自噬的細胞及含有自噬體的細胞中，由于mCherry與GFP共同表達，細胞呈現(xiàn)黃色熒光。當自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體后，酸性的溶酶體環(huán)境使酸敏感的GFP熒光淬滅，而mCherry不受影響，進而使自噬溶酶體呈現(xiàn)紅色熒光。因此，紅色熒光可指示自噬溶酶體形成的順利程度。紅色熒光越多，綠色熒光越少，則從自噬體到自噬溶酶體階段流通得越順暢。反之，自噬體和溶酶體融合被抑制，自噬溶酶體進程受阻（見圖4和附圖）。

維真現(xiàn)推出mCherry-GFP-LC3B腺病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒，滿足您實驗的不同需要。

·簡便直觀，實現(xiàn)自噬可視化； 

·準確指示，實現(xiàn)自噬流監(jiān)測。

 

 

 

自噬相關(guān)基因的病毒產(chǎn)品
自噬通路相關(guān)基因		表達載體		腺病毒載體		腺病毒
基因名稱	基因編號	產(chǎn)品貨號	貨期	產(chǎn)品貨號	貨期	產(chǎn)品貨號	貨期
alfy	NM_014991	CH852478	非現(xiàn)貨	AH852478	非現(xiàn)貨	VH852478	非現(xiàn)貨
ulk1	NM_003565	CH808275	非現(xiàn)貨	AH808275	非現(xiàn)貨	VH808275	非現(xiàn)貨
sqstm1	NM_003900	CH858197	現(xiàn)貨	AH858197	現(xiàn)貨	VH858197	現(xiàn)貨
sqstm1	NM_001142298	CH808956	非現(xiàn)貨	AH808956	非現(xiàn)貨	VH808956	非現(xiàn)貨
p150	NM_005407	CH815035	現(xiàn)貨	AH815035	現(xiàn)貨	VH815035	非現(xiàn)貨
fip200	NM_014781	CH801228	非現(xiàn)貨	AH801228	非現(xiàn)貨	VH801228	非現(xiàn)貨
p150	NM_012414	CH895682	非現(xiàn)貨	AH895682	非現(xiàn)貨	VH895682	非現(xiàn)貨
ampk	NM_017431	CH885062	現(xiàn)貨	AH885062	現(xiàn)貨	VH885062	現(xiàn)貨
ampk	NM_002733	CH842000	現(xiàn)貨	AH842000	現(xiàn)貨	VH842000	現(xiàn)貨
ampk	NM_006253	CH818994	現(xiàn)貨	AH818994	現(xiàn)貨	VH818994	現(xiàn)貨
ampk	NM_006252	CH801722	現(xiàn)貨	AH801722	非現(xiàn)貨	VH801722	非現(xiàn)貨
ampk	NM_206907	CH805185	非現(xiàn)貨	AH805185	非現(xiàn)貨	VH805185	非現(xiàn)貨
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atg16l1	NM_030803	CH886537	現(xiàn)貨	AH886537	非現(xiàn)貨	VH886537	非現(xiàn)貨
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