知識分享：質(zhì)粒提取實驗步驟
實驗原理
現(xiàn)在較常用的質(zhì)粒提取方法有三種:堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法，前兩種方法較為劇烈，適用于較小的質(zhì)粒（＜15Kb），而去污劑裂解法則比較溫合，一般用于分子量較大的質(zhì)粒（＞15Kb）。
堿裂解法是一種最廣泛使用的制備質(zhì)粒DNA的方法。其原理為：染色體DNA遠(yuǎn)大于質(zhì)粒DNA，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒為共價閉合環(huán)狀分子。當(dāng)pH值為 12.0-12.6，堿性環(huán)境中，線性的大分子的染色體DNA完全變性且無法復(fù)性，而共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA在將PH調(diào)至中性后即可恢復(fù)其天然構(gòu)象；在高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA為可溶狀態(tài)，通過離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA仍在上清中。殘留的雜質(zhì)可以通過酚氯仿處理掉。
實驗過程
1、實驗試劑
（1）溶液Ⅰ 50mMl 葡萄糖 / 10mMl EDTA / 25mMl Tris-HCl,pH=8.0；
（2）溶液Ⅱ 0.2Ml NaOH / 1% SDS；
（3）溶液Ⅲ 3Ml 醋酸鉀 / 2Ml 醋酸；
（4）異丙醇，無水乙醇，75%乙醇應(yīng)放-20℃冰箱預(yù)冷備用；
酚氯仿放4℃冰箱預(yù)存；
（5）搖菌，2-3ml相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)液，在37℃溫度下過夜培養(yǎng)。
2、質(zhì)粒提取
（1）菌液12000rcf離心5min，棄掉上清，加入0.2ml溶液I（已加入RNase），充分混勻后，加入0.25ml溶液II，顛倒混勻，室溫放置5min，加入0.4ml 溶液III，顛倒混勻后，13000rcf 離心30min。
（2）上清轉(zhuǎn)入新的1.5mlEP管中，加入等體積的酚氯仿混合液，充分混勻。10000rcf 離心10min。
（3）取上清，轉(zhuǎn)入新的EP管，加入等體積、預(yù)冷的異丙醇，充分混勻后，13000rcf 離心 6min。
（4）倒掉上清液，用1ml預(yù)冷的75%乙醇，顛倒后，13000rcf 離心 1min。
（5）倒掉上清液，沿壁加入1ml預(yù)冷的75%乙醇，直接倒掉。
（6）沿壁加入1ml預(yù)冷的乙醇，直接倒掉。倒扣5min后，室溫下放置10min。
待管內(nèi)液體會發(fā)干凈后，向管內(nèi)加入100ul水，55℃孵育5min。
（7）所得質(zhì)粒溶液可以放入-20℃中長期保存。
注意事項
- 若菌株為革蘭氏陽性菌，該菌有一層細(xì)胞壁，必須加入溶菌酶才能使之溶解。
- 搖床速度不宜過高。達(dá)到OD600 1.5即可。
- 溶液I加入RNase后需要放在4℃中保存，以防酶失活。
- 溶液II和溶液III使用前需注意觀察是否有沉淀，如有沉淀可37℃水浴處理。
- 溶液II處理菌體時間應(yīng)控制在5分鐘以內(nèi)。
常見問題及解決方法
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常見問題 |
原因 |
解決辦法 |
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質(zhì)粒濃度低 |
溶液處理不充分 |
增加溶液I/II/III的加入量，或降低菌液體積。 |
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質(zhì)粒拷貝數(shù)低 |
增加搖菌量，并降低最后的溶解體積 |
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菌體老化 |
重新質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或劃線后挑取單克隆搖菌 |
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乙醇?xì)埩?/p> |
乙醇的存在會影響質(zhì)粒的溶解和回收，須延長乙醇揮發(fā)時間 |
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洗脫液不合適 |
可配置合適的EB(10mM Tris-HCl, 1mMEDTA，pH8.5） |
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洗脫體積較小 |
在保證質(zhì)粒濃度的前提下，增加洗脫液的體積 |
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質(zhì)粒有雜帶 |
菌液污染 |
重新質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或劃線后挑取單克隆搖菌 |
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試劑污染 |
質(zhì)粒提取溶液重新配置，最后溶解液高壓滅菌后使用 |
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