產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

本產(chǎn)品僅限用于研究，嚴(yán)禁用于疾病診斷。

本產(chǎn)品僅供購(gòu)買(mǎi)方內(nèi)部研究使用，未經(jīng)維真生物公司書(shū)面許可，嚴(yán)禁轉(zhuǎn)售。

產(chǎn)品有限責(zé)任擔(dān)保

維真生物保證您收到的產(chǎn)品符合產(chǎn)品目錄上的規(guī)格。本擔(dān)保規(guī)定了維真生物更換產(chǎn)品的責(zé)任。維真生物不提供其他任何形式的對(duì)于產(chǎn)品商業(yè)或健康用途的保證。維真生物不對(duì)任何由于使用或不正確使用本公司產(chǎn)品造成的直接、間接的、衍生的或偶然的損害所產(chǎn)生的后果負(fù)責(zé)。

腺相關(guān)病毒安全操作規(guī)范

1. 請(qǐng)?jiān)贐L2生物安全二級(jí)生物安全柜中操作病毒。

2. 操作病毒和轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，請(qǐng)務(wù)必穿著實(shí)驗(yàn)服，佩戴口罩和手套。

3. 請(qǐng)小心操作，避免產(chǎn)生氣霧或飛濺。被病毒污染的超凈工作臺(tái)，請(qǐng)立即用70%乙醇加1% SDS溶液擦拭干凈。接觸病毒的槍頭、離心管、培養(yǎng)板、培養(yǎng)液請(qǐng)使用新鮮配制的10％漂白粉進(jìn)行消毒操作后丟棄。

4. 用顯微鏡觀察細(xì)胞感染情況時(shí)，請(qǐng)先擰緊培養(yǎng)瓶或蓋緊培養(yǎng)板，用70%乙醇擦拭培養(yǎng)瓶外壁后，顯微鏡下觀察拍照。觀察完畢，請(qǐng)用70%乙醇再次擦拭顯微鏡實(shí)驗(yàn)臺(tái)。

5. 離心病毒時(shí)，應(yīng)使用密封性好的離心管，或用封口膜封口后進(jìn)行離心，請(qǐng)盡量使用組織培養(yǎng)室內(nèi)的離心機(jī)。

6. 實(shí)驗(yàn)完畢脫掉手套后，請(qǐng)立即用肥皂和水清洗雙手。

個(gè)人保護(hù)措施

1. 使用一次性手套。

2. 在注射病毒或是其后的解剖時(shí)，使用一次性手術(shù)服或是相當(dāng)?shù)囊挛�，如果是感染�?xì)胞時(shí)，可以穿著實(shí)驗(yàn)服。

3. 佩戴護(hù)目鏡或是面罩。

4. 所有的操作應(yīng)當(dāng)是在 Class II 生物安全柜中進(jìn)行。如果實(shí)驗(yàn)條件不能滿足，則應(yīng)當(dāng)在空氣穩(wěn)定的空間中操作，減少操作時(shí)間和病毒與外界接觸的時(shí)間。

不慎接觸病毒時(shí)的急救

1. 病毒飛濺或是氣溶膠與人體接觸–眼，皮膚或是粘膜用大量清水沖洗眼睛或是其他接觸的部位至少15 分鐘。

2. 含病毒的針頭或是其他利器刺破皮膚。傷口立即用10%的碘伏溶液擦洗數(shù)分鐘，然后用大量清水沖洗。

消毒處理

對(duì)AAV 有效的消毒劑是新鮮配制的1%次氯酸鈉溶液。

♦ 配制時(shí)，將84 消毒液原液加水稀釋。

♦ 浸泡15min 以達(dá)到消毒目的。

♦ 可以用它處理可回收的物品如玻璃器皿或是污染廢液（終濃度是1%），但如果是不銹鋼器物切不可直接擦拭，否則會(huì)引起表面腐蝕。

其他的處理方式包括用2%戊二醛溶液或是0.25% SDS 溶液，還可以121℃高溫消毒1小時(shí)。

腺相關(guān)病毒的保存

收到產(chǎn)品后，請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需的量在無(wú)菌操作臺(tái)中將病毒進(jìn)行分裝，并于-80 ℃冰箱凍存。分裝病毒時(shí)請(qǐng)將病毒始終放置在冰上。

注：請(qǐng)避免反復(fù)凍融。

AAV載體概述

腺相關(guān)病毒(AAV)是一種無(wú)包膜的單鏈DNA病毒，是細(xì)小病毒家族的一員，通常需要腺病毒、皰疹病毒等輔助病毒的幫助，才能進(jìn)行自我復(fù)制。在沒(méi)有輔助病毒的情況下，

AAV可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中長(zhǎng)期潛伏�，F(xiàn)階段已發(fā)現(xiàn)的 AAV 有 12 種的血清型（AAV1 至 AAV12）和 130多種突變型[1] 。不同AAV血清型具有不同的衣殼蛋白空間結(jié)構(gòu)、序列和組織特異性，因而其識(shí)別與結(jié)合的細(xì)胞表面受體也相應(yīng)有很大差別[2]，這也導(dǎo)致不同血清型轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型和感染效率也各不相同。在基因治療中，將攜帶有外源基因的重組腺相關(guān)病毒定點(diǎn)整合到宿主基因組，既能克服隨機(jī)插入所導(dǎo)致的染色體缺失和基因重排等潛在危險(xiǎn)，又可以達(dá)到長(zhǎng)期治療的目的。

野生型AAV基因組編碼兩大開(kāi)放閱讀框架(open reading frames，ORF) rep和cap，它們位于兩側(cè)的末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列(interted teminal repeats，ITRs)之間。在 Vigenebio的AAV 病毒基因傳遞系統(tǒng)中，只有ITRs是復(fù)制和包裝所必需的順式元件，rep和cap 基因從病毒載體中被轉(zhuǎn)移到輔助質(zhì)粒AAV rep/cap Vector中，轉(zhuǎn)移后空出的位置是允許外源基因插入病毒基因組中的最大限度。在輔助質(zhì)粒Ad Helper Vector和pAAV-rep/cap Vector的幫助下，僅需兩端的 ITR 就能將攜帶的外源片段包裝進(jìn)入腺相關(guān)病毒顆粒。

重組腺相關(guān)病毒是基因傳遞和表達(dá)的一個(gè)重要工具[3]，其具有廣泛的宿主范圍及組織感染能力，既能感染分裂細(xì)胞，也能轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因進(jìn)入非分裂細(xì)胞，長(zhǎng)期表達(dá)外源基因，而不依賴于宿主細(xì)胞活躍的分裂能力。在Vigenebio公司的AAV病毒基因傳遞系統(tǒng)中，包含末端重復(fù)序列(ITRs)的載體質(zhì)粒pAV-FH AAV 載體與包含rep/cap 基因的輔助質(zhì)粒pAAV-rep/cap載體沒(méi)有任何共同區(qū)域，避免通過(guò)重組而恢復(fù)出野生型病毒，宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)被降至最低，從而允許對(duì)具有免疫能力的宿主細(xì)胞進(jìn)行基因傳遞。我們的AAV病毒基因傳遞系統(tǒng)可以生產(chǎn)出重組病毒滴度≥1011 病毒顆粒/毫升的病毒，濃縮后滴度最高可達(dá)1014 病毒顆粒/毫升，可以最大程度保證在動(dòng)物細(xì)胞中的基因傳遞。rAAV進(jìn)入細(xì)胞后，作為附加的DNA能穩(wěn)定存在�；�因的表達(dá)通常在第2〜7天出現(xiàn)峰值，并可在體內(nèi)持續(xù)數(shù)周甚至數(shù)月。

腺相關(guān)病毒基因傳遞和表達(dá)的優(yōu)勢(shì)

1.宿主范圍廣：隨時(shí)可轉(zhuǎn)染的AAV可高效感染分裂和非分裂細(xì)胞；

2.多種血清型 ：AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 和AAV9等；

3.安全性高：ITR 序列和 rep/cap 基因分別由獨(dú)立的質(zhì)粒表達(dá)；未發(fā)現(xiàn)AAV對(duì)人體致病，rAAV去除了wtAAV基因組的96%，進(jìn)一步保證了安全性；

4.免疫原性低：AAV2 的基因組僅 4681 個(gè)核苷酸，便于用常規(guī)的重組 DNA技術(shù)進(jìn)行操作，而且進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)造成的免疫反應(yīng)�。�

維真腺相關(guān)病毒的優(yōu)勢(shì)

1）載體全：不同的啟動(dòng)子（神經(jīng)特異性啟動(dòng)子Human Synapsin、CamkIIα、GFAP等）和多種報(bào)告基因（EGFP、mCherry、RFP和luciferase等）可供客戶選擇；

2) 貨期短：AAV克隆載體均與我們18,000個(gè)預(yù)制人類全長(zhǎng)cDNA ORF克隆載體MCS區(qū)通用，行業(yè)中的生產(chǎn)周期短；

3）滴度高：可提供 1012V.G/ml及以上滴度的病毒.，最高可達(dá)1014V.G/ml；

4）服務(wù)優(yōu)：可根據(jù)客戶的具體需求提供特殊定制服務(wù)。

維真 rAAV產(chǎn)品簡(jiǎn)介

維真獨(dú)有的專利技術(shù)和創(chuàng)新性的rAAV載體和完善的AAV 表達(dá)系統(tǒng)，可用于體內(nèi)和體外表達(dá)shRNA，human ORF和CRISPR，具有穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好、純度高、滴度高的優(yōu)點(diǎn)。

AAV無(wú)輔助病毒系統(tǒng)（AAV Helper-Free System）可以在無(wú)輔助病毒的條件下生產(chǎn)出重組人腺相關(guān)病毒。這種系統(tǒng)利用已經(jīng)明確與調(diào)節(jié)AAV 復(fù)制和表達(dá)的腺病毒基因產(chǎn)物，并且將這些基因產(chǎn)物通過(guò)轉(zhuǎn)染引進(jìn)宿主細(xì)胞。重組腺相關(guān)病毒（rAAV）由多個(gè)質(zhì)粒（Cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒、Rep/Cap質(zhì)粒）組成。生產(chǎn)具感染性的AAV 病毒顆粒所需的腺病毒基因產(chǎn)物（例如：E2A,E4 和VA RNA 基因）大部分由與其他質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的pHelper 質(zhì)粒提供，其余的腺病毒基因產(chǎn)物由穩(wěn)定表達(dá)腺病毒E1 基因的AAV-293T 宿主細(xì)胞提供。Rep 和Cap 基因從病毒載體中被轉(zhuǎn)移到輔助質(zhì)粒pAAV-RC 中，AAV ITRs 仍位于病毒載體中，實(shí)際上在輔助質(zhì)粒的幫助下，僅需兩端的ITR 就能將攜帶的外源片段包裝進(jìn)入腺相關(guān)病毒顆粒，Rep 和Cap 基因的轉(zhuǎn)移后空出的位置是允許外源基因插入病毒基因組中的最大限度。Cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒與Rep/Cap質(zhì)粒之間不具有同源性序列，因此重組AAV在理論上不具有復(fù)制的能力。Vigenebio的腺相關(guān)病毒載體ITR序列Rep/Cap基因分別由獨(dú)立的質(zhì)粒表達(dá),具有高度安全性。圖1為rAAV進(jìn)入細(xì)胞和轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程。

 

2.2 rAAV shRNA克隆服務(wù)

 

維真為您提供了多種表達(dá)shRNA的rAAV，包括U6或H1啟動(dòng)子和作為哺乳動(dòng)物表達(dá)標(biāo)記的GFP或RFP。同時(shí)，也可根據(jù)您感興趣的基因提供shRNA設(shè)計(jì)服務(wù)。

2.3 rAAV載體容量

腺相關(guān)病毒載體能夠感染分裂和非分裂細(xì)胞。毒性和免疫原性低，適合以相對(duì)較高的轉(zhuǎn)染效率在非分裂細(xì)胞中長(zhǎng)期表達(dá)和在分裂細(xì)胞中短期表達(dá)基因。但AAV載體的外源基因容納量有限，兩個(gè)ITR之間的空間只有4.9kb，因此可插入的外源基因?yàn)?.5kb甚至更小。請(qǐng)參閱本表選擇適合您的病毒載體系統(tǒng)。

腺相關(guān)病毒顆粒生產(chǎn)流程

第一步：基因克隆。將外源基因克隆進(jìn)入維真生物公司的人源或shRNA腺相關(guān)病毒載體，pAV-FH AAV等載體的多克隆位點(diǎn)與我們的human ORF穿梭克隆相兼容，非常適于哺乳動(dòng)物ORF的表達(dá)。

第二步：細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將攜帶外源基因的重組質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒Ad Helper Vector和pAAV-rep/cap Vector共轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293T細(xì)胞，感染72h之后即包裝完畢。

第三步：收毒。分別收獲培養(yǎng)基上清與細(xì)胞沉淀，PEG8000沉淀培養(yǎng)基上清中的病毒，培養(yǎng)基上清先用0.45um濾膜過(guò)濾。

第四步：病毒純化。通過(guò)碘克沙醇法對(duì)病毒進(jìn)行純化，一方面提高病毒滴度，另一方面某些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需要純化之后才可進(jìn)行。

第五步：滴度檢測(cè)。用QPCR的方法來(lái)檢測(cè)病毒的滴度，得到的結(jié)果為包裝得到的病毒顆粒數(shù)。

維真生物的pAV-FH AAV載體，具有Amp抗性、CMV啟動(dòng)子，帶有Flag-His標(biāo)簽。多克隆位點(diǎn)與維真的human ORF穿梭克隆相兼容。非常適于哺乳動(dòng)物ORF的表達(dá)。維真生物為您提供了多種表達(dá)shRNA的rAAV，包括U6或H1啟動(dòng)子和作為哺乳動(dòng)物表達(dá)標(biāo)記的GFP或RFP。同時(shí)，也可根據(jù)您感興趣的基因提供shRNA設(shè)計(jì)服務(wù)。

pAAV-rep/cap質(zhì)粒（圖）包含AAV編碼復(fù)制蛋白和病毒衣殼蛋白的rep和cap基因，獲得期望的高滴度病毒產(chǎn)品的關(guān)鍵基因。

pHelper 質(zhì)粒（圖）包含AAV-HEK293T 生產(chǎn)高滴度病毒必須的的腺病毒基因VA，E2A 和E4 的集合。提供AAV 生產(chǎn)所必需的腺病毒蛋白質(zhì)E1A 和E1B 在HEK293T 細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。

1.腺相關(guān)病毒重組克隆構(gòu)建

1）根據(jù)訂單不同選擇不同的載體，在此以人源基因克隆為例。

2）維真生物公司的AAV載體與我們的人源ORF庫(kù)中的穿梭質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)相兼容，通過(guò)酶切，連接，轉(zhuǎn)化的方式將基因亞克隆進(jìn)入pAV-FH AAV載體，得到陽(yáng)性克隆之后進(jìn)行酶切跑膠驗(yàn)證及測(cè)序以確認(rèn)插曲片段的正確性。

2.細(xì)胞凍存流程

1)按照培養(yǎng)細(xì)胞流程，將細(xì)胞吹下來(lái)加入50ml離心管中， 800g離心5min。

2)配制凍存液，90% 血清，10% DMSO，混勻。

3)離心后去上清，將配制的凍存液加入，將細(xì)胞吹勻

4)取上述溶液1ml分至1.5ml細(xì)胞凍存管中，做好標(biāo)記和日期。

5)放入裝有異丙醇的凍存盒中，放入-80度冰箱過(guò)夜。（凍存盒要提前一天從冰箱中拿至室溫，使異丙醇的溫度達(dá)到室溫，每次凍存前確保異丙醇的加入量在刻度線上）。

6)第二天將凍存盒放入液氮或-150℃冰箱中。

3.細(xì)胞復(fù)蘇流程

1)10cm培養(yǎng)盤(pán)中加10cm新鮮DMEM培養(yǎng)基，放培養(yǎng)箱預(yù)熱至37℃。

2)從液氮中取出冷凍管，迅速投入37 ℃ ～38℃水浴中，使其融化（1-2分鐘左右）。

3)待細(xì)胞凍存管中溶液尚未完全融化時(shí)加入預(yù)熱的培養(yǎng)盤(pán)中。

4)搖晃均勻，放培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

5)4h后待細(xì)胞完全貼壁后更換新鮮培養(yǎng)基（除去凍存液中DMSO對(duì)細(xì)胞的毒害作用。也可在第3步中800g離心5min，除去培養(yǎng)基后再懸浮細(xì)胞添加至新鮮預(yù)熱的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)皿中）。

4.細(xì)胞培養(yǎng)流程（以10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，傳代為例）

1)生物安全柜紫外滅菌半小時(shí)。

2)滅菌期間，DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS，1%青鏈霉素混合液)、PBS以及0.25%胰酶在37℃水浴鍋中預(yù)熱。

3)取匯合度接近100%活性好的的HEK293T細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)盤(pán)中培養(yǎng)基，加約5ml，1 ×PBS，搖晃幾下，吸棄PBS。（加PBS目的主要除去殘留在皿中的培養(yǎng)基中的FBS，以提高胰酶的消化效率）

4)加1ml 0.25% 胰酶在生物安全柜內(nèi)消化約1min，室溫低時(shí)可放置于培養(yǎng)箱中消化。消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則影響細(xì)胞再次貼壁效率和活性。

5)加入約5ml的預(yù)熱的培養(yǎng)基。

6)用移液管吹打均勻，按照1:3比例傳代。各洗2ml培養(yǎng)基至新的10cm皿中，再加入8ml預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)基。（吹打過(guò)程中不可用力過(guò)大，否則會(huì)吹破細(xì)胞）。

注意：傳代盤(pán)數(shù)較多時(shí)，要先將預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)基加入到10cm皿中，再加入含細(xì)胞的培養(yǎng)基，以避免細(xì)胞分布不均。放置于培養(yǎng)箱前輕輕混勻皿中的培養(yǎng)基，使細(xì)胞均勻分散于培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)條件為5%-7%CO2濃度，37℃，培養(yǎng)箱內(nèi)無(wú)菌水盤(pán)內(nèi)水份提供一定的濕度。

細(xì)胞傳盤(pán)以及分6孔板，24孔板，96孔板分細(xì)胞都經(jīng)過(guò)上述流程，只是細(xì)胞數(shù)與分的比例不同，具體情況具體操作。

 

5.AAV 病毒包裝

以10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿為例

第一天: 聚合度90%以上的HEK293T細(xì)胞按1：3比例傳盤(pán)（每盤(pán)大約2.5 x 106），培養(yǎng)基Hyclone高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS）。

第二天: 轉(zhuǎn)質(zhì)粒前1-2h左右，換成無(wú)血清培養(yǎng)基（所有血清型AAV），用轉(zhuǎn)染試劑將目的基因質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒（需用酚氯仿提取的質(zhì)粒）轉(zhuǎn)入HEK293T中。

第三天：質(zhì)粒轉(zhuǎn)化24h后，換新的無(wú)血清培養(yǎng)基（所有血清型AAV）

第五天：轉(zhuǎn)染72h收毒。帶著培養(yǎng)基，吹下細(xì)胞，離心；然后分別收獲培養(yǎng)基上清與細(xì)胞沉淀。用PEG8000沉淀培養(yǎng)基上清中的病毒，沉淀過(guò)夜后收集病毒沉淀。

6.AAV病毒純化

1)收集病毒沉淀和細(xì)胞沉淀。

2)細(xì)胞沉淀-80℃保存，后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。

3)破碎細(xì)胞。

4) 將病毒的混合液用碘克沙醇密度梯度離心進(jìn)行純化。

7.病毒濃縮

用超濾管進(jìn)行濃縮。

8.病毒滴度檢驗(yàn)

1)腺性相關(guān)病毒處理破除AAV病毒外殼 ，37 ℃ 孵育30 min，然后加熱 95 ℃5 min 使酶失活，體系如下：

組成成分

體積

病毒液

5ul

蛋白酶K（5ug/ul）

1ul

超純水

4ul

2)離心12000rpm,2min.取上清。

3)標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)，7個(gè)梯度稀釋濃度分別：7.2E+8V.G./UL,7.2E+7V.G./UL,7.2E+6V.G./UL,7.2E+5V.G./UL,7.2E+4V.G./UL,7.2E+3V.G./UL,7.2E+2V.G./UL.并將超純水作為陰性對(duì)照。

4)配制PCR反應(yīng)體系，每個(gè)樣品20 ul體系，體系如下：

組成成分

體積

2X SYBRGreen緩沖液

10ul

F、R引物混合物

0.8ul

超純水

7.2ul

病毒樣品或標(biāo)準(zhǔn)品

2ul

5)PCR反應(yīng)體系

組成成分

體積

95℃

5min；

95℃

15sec

60℃

15sec

72℃

15sec

40個(gè)cycles

6)病毒顆粒數(shù)公式：病毒顆粒數(shù)（個(gè)/ml）= 與標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)值 × 1000

腺相關(guān)病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)

以2型AAV病毒為例，維真生物為您推薦的MOI值10000:1-100000:1，是根HEK293T細(xì)胞得出的數(shù)據(jù)，不同的細(xì)胞所使用的病毒MOI值會(huì)有所不同。建議您感染目的細(xì)胞前，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳MOI值，推薦使用有熒光的對(duì)照病毒來(lái)摸索條件。

1. 為了節(jié)省病毒，推薦使用96孔板進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。

2. 將目的細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞融合率為50%為最佳。為保證細(xì)胞生長(zhǎng)良好，請(qǐng)保證細(xì)胞貼壁過(guò)夜。

3. 取10ul AAV病毒原液加入90 ul培養(yǎng)基中做1:100稀釋（10-2），以此為起點(diǎn)做梯度稀釋直至稀釋10-7�？筛鶕�(jù)實(shí)際情況降低或提高稀釋倍數(shù)。

4. 取出提前準(zhǔn)備好的96孔板，先確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀況是否良好。用準(zhǔn)備好的病毒稀釋液替代舊培養(yǎng)基，注意保留未加入病毒的細(xì)胞孔作為對(duì)照組。

5. 在加入病毒稀釋液后，請(qǐng)?jiān)?2-24h后觀察細(xì)胞狀態(tài)來(lái)確認(rèn)加入的病毒量是否合適，是否因?yàn)榧尤氲牟《玖坑绊懠?xì)胞狀態(tài)。如果細(xì)胞沒(méi)有變化，即所加病毒對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性，可以繼續(xù)培養(yǎng)。

6. AAV病毒對(duì)細(xì)胞的感染較慢，請(qǐng)?jiān)诟腥炯?xì)胞后每天觀察細(xì)胞中熒光表達(dá)情況。 (成功案例: 山大醫(yī)院學(xué)生

 

 

利用我司提供的AAV病毒感染jurkat，ca46細(xì)胞,在MOI值105時(shí),

一個(gè)星期后看到熒光表達(dá),并且成功通過(guò)WB檢測(cè)到目的基因的表達(dá))（如果您選擇的產(chǎn)品帶有GFP標(biāo)簽，如果沒(méi)有熒光標(biāo)簽請(qǐng)選擇在96小時(shí)以后的不同時(shí)間段分別收獲細(xì)胞并通過(guò)Western-Blot或其他檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)）。

注：由于AAV組織特異性，體外感染細(xì)胞的效率比較低，所以我們強(qiáng)烈推薦您購(gòu)買(mǎi)AAV用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

AAV使用情況實(shí)例分析

1.AAV感染不同種類的細(xì)胞

HEK293T

 

 

AAV雖然也可體外感染一些細(xì)胞，但感染效率比較低。具體感染效率可以參考本手冊(cè)的常見(jiàn)問(wèn)題解答中的附表。

2.AAV感染神經(jīng)干細(xì)胞

 

Sorted cells were expanded for an additional26 days (total 40 days after AAV infection), and ~94.5% of cells maintained GFP and nestin expression

Jang J H, Koerber J T, Kim J S, et al. An evolved adeno-associated viral variant enhances gene delivery and gene targeting in neural stem cells[J]. Molecular Therapy, 2011, 19(4): 667-675.

由于AAV的低免疫原性，即便感染干細(xì)胞，也不會(huì)引起細(xì)胞的分化。

3.各種類型的重組AAV注射入不同神經(jīng)發(fā)育階段的小鼠腦內(nèi)產(chǎn)生不同分布

 

Chakrabarty P, Rosario A, Cruz P, et al. Capsid serotype and timingof injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain[J]. PloS one, 2013, 8(6): e67680.

注射方法：腦室注射

注射劑量：2×1010 v.p

4.不同血清型的AAV感染心臟心肌細(xì)胞

 

由于組織特異性，即便提高病毒的注射量，對(duì)于低表達(dá)的血清型，其所攜帶基因的表達(dá)水平?jīng)]有太大的改善。由圖可知，AAV9型對(duì)心肌細(xì)胞的感染效率極高，AAV8次之。

5.重組AAV1-SERCA2a轉(zhuǎn)導(dǎo)入豬冠狀動(dòng)脈的表達(dá)

 

Hadri L, Bobe R, Molecular Therapy, 2010, 18(7): 1284-1292.

注射方法：冠狀動(dòng)脈注射

注射劑量：1012v.p

6. AAV1特異性感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及不同類型AAV感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的效果

 

Edmund R Hollis II， Ken Kadoya， Matthew Hirsch， Richard J Samulskiand Mark H Tuszynski ，Molecular Therapy , vol16 ,no. 2, feb, 2008.

注射方法：神經(jīng)肌肉注射

注射劑量：2.1x10E8 v.p

分別用AAV1-6感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)，AAV1的效果好，感染運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)目最多。

7.不同血清型AAV 體外注射大鼠5天后在腦的海馬回中的表達(dá)

 

Ronald L. Klein, Robert D. Dayton, Nancy J. Leidenheimer, Karen Jansen, Todd E. Golde, and Richard M. Zweig. MOLECULAR THERAPY, 2006, 3 , 13(3).

8.AAV2在研究小鼠脈絡(luò)膜新生血管形成中作為基因?qū)�入的載體

 

Therapeutic effect of CBAPEDF-AAV2 on choroidal neovascularization development and antibody responses to AAV2 capsid following single and sequential intravitreal injections.A-D:Representative CNV images from mouse eyes that were untreated (A), received a single intravitreal (IV) treatment (B), received first IV treatment (C), and received a second IV treatment (D) of AAV2-PEDF.

Qiuhong Li, Rehae Miller, Ping-Yang Han, Jijing Pang, Astra Dinculescu, Vince Chiodo, William W. Hauswirth. Molecular Vision, 2008, 14:1760-1769.

注射方法：玻璃體腔內(nèi)注射

注射劑量：4x10E10 V.G.

9.AAV7,8感染視錐形細(xì)胞

 

 

注射方法：在接近晶狀體的虹膜上切開(kāi)一個(gè)小口后，緩慢（20-30秒內(nèi)）注射。至少在3個(gè)星期后進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

注射劑量：2ul。

10. scAAV9 介導(dǎo)的CB-GFP標(biāo)記靜脈注射入大鼠3周后在腦的星形膠質(zhì)和神經(jīng)元中表

 

a:紋狀體; b:海馬回；c:齒狀回；d :小腦浦肯野細(xì)胞; e:海馬回的椎體細(xì)胞f:齒狀回的顆粒細(xì)胞；a-d 新生鼠 e-f成年鼠（f）200 mm (e); 100 mm (f),50 mm (a–d)Foust K D, et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes[J]. Nature biotechnology, 2009, 27(1): 59-65.

注射方法：尾靜脈注射

注射劑量：4 × 1011v.p

11.AAV8感染肝臟肝細(xì)胞

 

注射方法：尾部靜脈注射

注射體積：200ul、1012v.p

12. AAV9 介導(dǎo)的標(biāo)記注射成年小鼠7周后在脊髓和大腦的表達(dá)

 

a-d:頸椎，e-h:腰椎，i-l:星形膠質(zhì)細(xì)胞，m-p:腦

Foust K D, et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult

astrocytes[J]. Nature biotechnology, 2009, 27(1): 59-65.

注射方法：尾靜脈注射

注射劑量：4 × 1012v.p

13. AdVLacZ, AAV2LacZ, 和 AAV8LacZ 介導(dǎo)的標(biāo)記在C57Bl/6鼠的胰腺中的表達(dá)

AdVLacZ AAV2LacZ AAV8LacZ

 

胰腺胰島細(xì)胞

Wang A Y, et al. Comparison of adenoviral and adeno-associated viral vectors for pancreatic gene delivery in vivo[J]. Human gene therapy, 2004, 15(4): 405-413.

注射方式：胰腺注射

注射劑量： AdVLacZ-108pfu；AAV2，8LacZ-1011v.p

AAV比腺病毒的持續(xù)表達(dá)時(shí)間要長(zhǎng)很多，通常AAV可在體內(nèi)表達(dá)數(shù)周甚至數(shù)月，但是腺病毒僅能表達(dá)幾天。

14. AAV-1-6，8 和慢病毒介導(dǎo)的GFP在大鼠的脊髓中的表達(dá)

 

Blits B, Derks S, Twisk J, et al.Journal of neuroscience methods, 2010, 185(2): 257-263.

注射方法：脊髓注射

注射劑量：注射5×108v.p不同外殼的AAV 病毒

由圖顯示，AAV介導(dǎo)的在大鼠脊髓中的基因表達(dá)要比慢病毒介導(dǎo)的表達(dá)更高。AAV比慢病毒更容易轉(zhuǎn)染脊髓。

常見(jiàn)問(wèn)題解答

1.什么是Adeno-associated virus (AAV) &重組AAV(rAAV) & helper free rAAV?

腺相關(guān)病毒（AAV）屬于微小病毒科，是一類小的、二十面體、無(wú)包膜病毒。AAV是一種復(fù)制缺陷病毒，復(fù)制依賴于其他輔助病毒，如腺病毒和皰疹病毒。AAV不編碼自己的聚合酶，因此其復(fù)制過(guò)程依賴于宿主細(xì)胞的聚合酶活性。

重組AAV（rAAV）是人工改造的AAV，沒(méi)有編碼AAV病毒復(fù)制和結(jié)構(gòu)蛋白的rep和cap基因。rAAV中與復(fù)制和包裝相關(guān)的rep和cap 基因被替換為ITRs間的基因或結(jié)構(gòu)，這使rAAV具有4.1-4.9 kb的包裝容量。

2.使用AAV有哪些生物安全性要求?

可在生物安全1級(jí)（BSL-1）實(shí)驗(yàn)室操作生產(chǎn)無(wú)輔助病毒和編碼非致癌基因的重組AAV。另外，應(yīng)在生物安全2級(jí)（BSL-2）實(shí)驗(yàn)室封閉處理具有生物危害性的材料。

3.重組AAV 安全嗎?

迄今為止，未發(fā)現(xiàn)野生型AAV有致病性。野生型AAV，在無(wú)需輔助病毒（如腺病毒）的存在下，復(fù)制效率非常低。重組腺相關(guān)病毒（rAAV）由多個(gè)質(zhì)粒（cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒、rep/Cap質(zhì)粒）組成。Cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒與rep/Cap質(zhì)粒之間不具有同源性序列，因此重組AAV在理論上不具有復(fù)制的能力。

4.重組AAVs的克隆容量有多大?

AAV具有〜4.7Kb的包裝能力。2個(gè)ITR之間插入的DNA長(zhǎng)度接近允許的最大值4.7Kb時(shí)，包裝效率顯著降低。例如，對(duì)于過(guò)表達(dá)來(lái)自cDNA的基因，CMV-poly（A）信號(hào)元件約為1KB，因此最大可包裝的cDNA長(zhǎng)度約為3.2kb，如果共表達(dá)GFP（約0.8kb），則可包裝的容量大約為2.4kb。

5.哪些血清型的 AAV 可供選擇？我該選用哪種AAV呢?

目前為您提供的AAV 血清型為AAV1，AAV2，AAV5，AAV7，AAV6，AAV8 & AAV9。請(qǐng)參閱下面指南中參考文獻(xiàn)的建議。

 

 

請(qǐng)同時(shí)參閱轉(zhuǎn)染效率與不同細(xì)胞類型對(duì)照表，以確定哪種血清型AAV更適合您的細(xì)胞。

6.使用重組腺相關(guān)病毒rAAV傳遞基因的優(yōu)勢(shì)是什么?

rAAV病毒滴度很高，可感染分裂和非分裂細(xì)胞、免疫原性極小、體內(nèi)表達(dá)外源基因時(shí)間長(zhǎng)。

7.AAV 載體穩(wěn)定嗎? 如何保存AAV載體 ?

純化的AAV載體在4℃或更低溫度下高度穩(wěn)定。建議您將AAV分裝后，-80℃下長(zhǎng)期保存。

8.訂制AAV服務(wù)，客戶需要提供哪些材料? &客戶收到的產(chǎn)品是怎樣的?

您可以從我們的人源全長(zhǎng)cDNA庫(kù)(17,000預(yù)制ORF)中挑選，或者提供您的質(zhì)粒DNA或DNA序列，我們將基因克隆至AAV載體。您還可以指定特定的融合標(biāo)簽和AAV血清型。

基因沉默服務(wù)，請(qǐng)您提供確切的shRNA的序列以構(gòu)建重組rAAV載體。我們的標(biāo)準(zhǔn)載體具有U6啟動(dòng)子和GFP標(biāo)記。

通常情況下，可為客戶提供500 ul病毒液1×10^12 V.G. /ml。也可根據(jù)客戶的需要，提供特定體積和滴度的產(chǎn)品。