實驗原理：

轉染是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉染目前已成為實驗室工作中經常涉及的基本方法。

常規(guī)轉染技術可分為兩大類,一類是瞬時轉染,一類是穩(wěn)定轉染（永久轉染）。前者外源 DNA /RNA不整合到宿主染色體中,因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數,產生高水平的表達,但通常只持續(xù)幾天,多用于啟動子和其它調控元件的分析。一般來說，超螺旋質粒DNA轉染效率較高，在轉染后24-72小時內（依賴于各種不同的構建）分析結果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。后者也稱穩(wěn)定轉染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉入量低但整合率高，外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉染細胞能整合，通常需要通過一些選擇性標記，如來氨丙基轉移酶（APH；新霉素抗性基因）、潮霉素B磷酸轉移酶（HPH）、胸苷激酶（TK）等反復篩選，得到穩(wěn)定轉染的同源細胞系。

轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過物理方法將基因導入細胞的范例；化學介導方法很多，如經典的磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術；生物介導方法，有較為原始的原生質體轉染，和現在比較多見的各種病毒介導的轉染技術。

理想細胞轉染方法，應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優(yōu)點。病毒介導的轉染技術，是目前轉染效率最高的方法，同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢。但是，病毒轉染方法的準備程序復雜，常常對細胞類型有很強的選擇性，在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉染方法，則各有其特點。

需要指出的一點，無論采用哪種轉染技術，要獲得最優(yōu)的轉染結果，可能都需要對轉染條件進行優(yōu)化。影響轉染效率的因素很多，從細胞類型、細胞培養(yǎng)條件和細胞生長狀態(tài)，到轉染方法的操作細節(jié)，都需要考慮。

常見的轉染方法及比較

轉染技術的選擇對轉染結果影響也很大，許多轉染方法需要優(yōu)化DNA與轉染試劑比例、細胞數量、培養(yǎng)及檢測時間等。一些傳統(tǒng)的轉染技術，如DEAE右旋糖苷法、磷酸鈣法、電穿孔法,、脂質體法各有利弊,其主要主要原理及應用特點如下：

 除上述傳統(tǒng)方法外，近年來國際上推出了一些陽離子聚合物基因轉染技術，以其適用宿主范圍廣、操作簡便、對細胞毒性小、轉染效率高受到研究者們的青睞.其中樹枝狀聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亞胺（Polyethylenimine,PEI）的轉染性能最佳，但樹枝狀聚合物的結構不易于進一步改性，且其合成工藝復雜。聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機大分子，每相隔二個碳個原子，即每“第三個原子都是質子化的氨基氮原子，使得聚合物網絡在任何pH下都能充當有效的“質子海綿”(proton sponge)體。這種聚陽離子能將各種報告基因轉入各種種屬細胞，其效果好于脂質聚酰胺，經進一步的改性后，其轉染性能好于樹枝狀聚合物，而且它的細胞毒性低。大量實驗證明，PEI是非常有希望的基因治療載體。目前在設計更復雜的基因載體時，PEI經常做為核心組成成分。
  線型PEI（Line PEI，LPEI）與其衍生物用作基因轉染載體的研究比分枝狀PEI（Branched PEI，BPEI）要早一些，過去的研究認為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉染復合物的細胞毒性較低，有利于細胞定位，因此與BPEI相比應該轉染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉染復合物，從而提高轉染效率，但同時細胞毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實驗中發(fā)現這種PEI的毒性低，但轉染效率卻較高.。

GenEscort是采用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各種含有生理條件下可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián)，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝結構使得其具有較高的正電性，因此易于高效地包裹各種DNA、RNA分子及質粒形成小的納米顆粒 ,從而提高轉染效率，當所形成復合物進入細胞以后，其中所含的生理條件下可降解的化學鍵在細胞內水解，使交聯(lián)聚合物分解為無細胞毒性的小分子PEI，這樣結構的轉染試劑在體外應用可以獲得高的轉染效率和低的細胞毒性，其可降解性對體內應用也具有重要的意義。

實驗材料：

15ml離心管、培養(yǎng)皿、滴管 、酒精燈、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液、胎牛血清、轉染試劑、質粒、PBS、75%酒精、0.25%胰酶、超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、顯微鏡、離心機、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、廢液缸等。

實驗步驟（以脂質體轉染為例）：

脂質體(LR)試劑是陽離子脂質體DOTMA和DOPE的混合物(1：1)。它適用于把 DNA 轉染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中，是目前條件下最方面的轉染方法之一。轉染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA轉染到各種細胞。
用LR進行轉染時，首先需要優(yōu)化轉染條件，應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做。先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間，DNA可從1-5ug和孵育時間6h，開始，按這兩個參數繪出相應LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者最佳的劑量，確定出轉染時間。因LR對細胞有一定的毒性，轉染時間以不超過24h為宜。

一、方法一的操作步驟
1、取6孔培養(yǎng)板，向每孔中加入2ml含(1-2) x 10 5 個細胞的培養(yǎng)基，37℃、18% CO 2 培養(yǎng)基40%-60%匯合時。

2、轉染液制備：在聚苯乙烯管中制備以下兩液(為轉染1個空細胞所用的量)。
A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋DNA使?jié)舛葹?-10ug，終量100ul。
B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋LR，使終濃度為2-50ug，終量100ul。
輕輕混合A液、B液，室溫中置10-15min，稍后會出現微濁現象，但并不妨礙轉染。
3、轉染準備：用2ml不含血清培養(yǎng)基漂洗2次，再加入1ml不含血清培養(yǎng)基。
4、轉染：把A/B復合物緩緩加入培養(yǎng)基中，搖勻，置37℃溫箱中6-24h，吸除無血清轉染液，換入正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
5、其余處理：如觀察、篩選、檢測等與其他轉染法相同。
6、注意：轉染時切勿加血清，血清對轉染效率有很大影響。

二、快速脂質體轉染法操作步驟(方法二)：
1、 將細胞以5 x 105個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24h，使其達到50%-60%板底面積。
2、 在試管中配制DNA-脂質體復合物。
a. 在1ml無血清DMEM中稀釋PSV1-neo質粒DNA或供體DNA。
b. 旋轉1s，再加入脂質體懸液，旋轉。
c. 室溫下放置5-10min，使DNA結合在脂質體上。
3、 棄去細胞中的舊液，用1ml無血清DMEM洗細胞1次后棄去，向每孔中直接加入1mlDNA-脂質體復合物，37℃培養(yǎng)3-5天。
4、再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)14-24h。
5、吸出DMEM-DNA-脂質體混合物加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM，2ml/孔，再培養(yǎng)24-48h。
6、用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定。

三、穩(wěn)定的脂質體轉染法：
1、接種細胞同前述，細胞長至50%板底面積可用于轉染。
2、DNA-脂質體復合物制備轉染細胞同前。
3、在每孔中加入1ml含20%胎牛血清的DMEM，37℃培養(yǎng)48h。
4、吸出DMEM，用G418選擇性培養(yǎng)基稀釋細胞，使細胞生長一定時間，篩選轉染克隆，方法參照細胞克隆篩選法進行。

四、Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板轉染單層貼壁細胞。(別的方法可以參考生產商提供的protocol)
1、轉染前1天將0.5～2×105細胞接種于24孔培養(yǎng)板，并加入500ul不含 抗生素 的完全培養(yǎng)基，以保證轉染時細胞匯合達90～95％。
2、準備復合物
a. 將0.8ug DNA稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中輕輕渾勻。
b. 將2ul Lipofectamine2000稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中，輕輕渾勻，室溫孵育5分。注意：必須在25分內進行。
c. 5分后將它們混合，并輕輕渾勻，室溫孵育20分。
3、吸去培養(yǎng)板的培養(yǎng)基，用PBS或無血清培養(yǎng)基(最好)清洗細胞2次。
4、將復合物(總體積100ul)加入培養(yǎng)孔，前后搖動培養(yǎng)板使其分布均勻。
5、將細胞放入 培養(yǎng)箱 孵育4～6h后，可以更換含血清培養(yǎng)液去除復合物(也可不用)。
6、24～48h后可以觀察轉入 基因表達 情況。
7、穩(wěn)定轉染：換含血清培養(yǎng)基24h后將細胞以1：10(或更高比例)傳代，1天后更換篩選培養(yǎng)基篩選。
8、優(yōu)化：要保證細胞匯合率達90～95％(比較高)；DNA/ Lipofectamine2000比率1：0.5～1：5，一般細胞1：2～3。

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