實(shí)驗(yàn)原理：

利用哺乳動(dòng)物系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白的方式有兩種：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選。通過穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。針對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，外源基因在短時(shí)間轉(zhuǎn)錄翻譯得到的蛋白量較少，能夠滿足小量蛋白制備，大量生產(chǎn)成本很高。相對(duì)于此，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的是將外源基因整合到細(xì)胞自身的基因組上，隨著細(xì)胞的生長分裂外源基因可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)，同時(shí)經(jīng)過抗生素加壓篩選，最終得到能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)蛋白的細(xì)胞株，穩(wěn)轉(zhuǎn)株生產(chǎn)蛋白穩(wěn)定性更好，批次差異性更小。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的應(yīng)用

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染適用原因	穩(wěn)定轉(zhuǎn)染應(yīng)用
外源基因要整合到細(xì)胞染色體上	基因敲除以及基因插入突變篩選等修飾基因組的研究
細(xì)胞之間存在個(gè)體差異，同一類型細(xì)胞，不同個(gè)體細(xì)胞 基因組存在差異，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾	單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選
外源基因未整合到細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致注射入動(dòng)物體內(nèi)后，外源 基因片段很快丟失	需要在動(dòng)物體體內(nèi)注射已經(jīng)表達(dá)外源基因的細(xì)胞
一些蛋白穩(wěn)定性很強(qiáng)，瞬時(shí) RNA 干擾作用周期短，無法去除已經(jīng)表達(dá)的目的蛋白	需要通過穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選，實(shí)現(xiàn)更好的基因干擾效果
穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選很大程度上降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的 成本，也很大程度上方便實(shí)驗(yàn)研究	在某些細(xì)胞中長期研究基因的功能
通過穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選，能使那些病毒載體也無法達(dá)到高轉(zhuǎn)導(dǎo) 效率的細(xì)胞高效表達(dá)外源片段	獲得外源片段的高效表達(dá)
避免引入人為因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性，穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選 有助于篩選出拷貝數(shù)適量的細(xì)胞	得到過表達(dá)的目的基因或干擾拷貝數(shù)

影響穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的因素

1、外源基因整合的幾率

決定了穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選的簡易程度，有利于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的獲得；

2、插入外源基因片段的拷貝數(shù)

一般情況下，低拷貝或者單拷貝可以降低人為因素的干擾；

3、整合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄活躍度

整合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄活躍度決定了穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選細(xì)胞后穩(wěn)轉(zhuǎn)株中外源基因片段的表達(dá)質(zhì)量；

4、外源基因片段整合到細(xì)胞后的穩(wěn)定性

不同的整合位點(diǎn)決定了外源片段在染色體中的穩(wěn)定性，有些區(qū)域易發(fā)生重組或者丟失，從而使穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選后出現(xiàn)丟失的現(xiàn)象。

制備穩(wěn)轉(zhuǎn)株的實(shí)驗(yàn)步驟

一．準(zhǔn)備及預(yù)實(shí)驗(yàn)

1、確定細(xì)胞系相關(guān)信息：需包括如下內(nèi)容

細(xì)胞系名稱

細(xì)胞培養(yǎng)條件

細(xì)胞增殖速度

支原體污染情況

注：務(wù)必保證細(xì)胞無支原體污染，方可進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建！

2、查閱慢病毒感染該細(xì)胞的MOI值

3、預(yù)實(shí)驗(yàn)確定篩選藥物用量：

（1）查閱Puromycin/Blastincidin在目的細(xì)胞中穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選的致死用量信息；參考查閱得到的數(shù)據(jù)，確定3個(gè)藥物濃度梯度（如沒有相關(guān)信息，則需將藥物濃度梯度范圍增大，數(shù)量增多至6個(gè)）；

（2）D0將細(xì)胞鋪于6孔板中，使D1細(xì)胞融合度約90%；D1按（1）中設(shè)置的藥物梯度，加入藥物；

（3）D4換液，并重新加入藥物；

（4）D7觀察，找到致死率100%的孔，該孔使用的藥物濃度，即為藥物篩選濃度。

二．穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選及構(gòu)建

注：以下實(shí)驗(yàn)參數(shù)，按1株穩(wěn)轉(zhuǎn)株為例描述，實(shí)驗(yàn)需考慮有無對(duì)照穩(wěn)轉(zhuǎn)株！

1、細(xì)胞鋪板：D0將細(xì)胞接種于6孔板中（4個(gè)孔），使D1細(xì)胞融合度約70%

病毒感染：

2、慢病毒上清：分別棄去6孔板中3個(gè)孔的0.5毫升培養(yǎng)基、1毫升培養(yǎng)基、2毫升培養(yǎng)基和，分別加入2毫升慢病毒上清、1.5毫升慢病毒上清和0.5毫升慢病毒上清；

3、純化慢病毒：選3個(gè)孔，并可按推薦MOI、大于此MOI及小于此MOI，共三個(gè)MOI值，添加慢病毒；

4、觀察感染效率：感染后72小時(shí)，觀察感染效率，效率高于80%最佳，最低不應(yīng)低于40%，選擇1-2個(gè)感染效率較好的孔。

5、篩選：

(1)多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株：從感染72小時(shí)后開始于6孔板中加篩選藥物，每隔2天，重新?lián)Q液加入藥物。藥物篩選需至少持續(xù)14天，直至顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞比例為100%。

注：第一次加入藥物時(shí)在上午進(jìn)行，4-6小時(shí)后觀察細(xì)胞狀態(tài)，如細(xì)胞死亡過多，需更換新鮮不含藥物的培養(yǎng)基。

(2)單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株：建立在獲得多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株基礎(chǔ)上。

A、有限稀釋法：

a.取24個(gè)1.5毫升EP管，每管中加入800毫升完全培養(yǎng)基；

b.用胰酶將多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株消化（90%融合度，10毫升培養(yǎng)基終止消化），取80微升至第一個(gè)EP管中，混合均勻；

注：應(yīng)使用1000微升槍尖，混合時(shí)不要過度吸打，以免破壞細(xì)胞。

c.從第一個(gè)EP管中取80微升至第二個(gè)EP管中，混合均勻，以此類推。

d.將EP管中的細(xì)胞懸液，以每孔100微升，接種于96孔板中；

e.過夜培養(yǎng)后，觀察第12-24列，尋找只含有1個(gè)細(xì)胞的孔，并做好標(biāo)記；

f.培養(yǎng)3-4周，待標(biāo)記孔中細(xì)胞擴(kuò)增后，消化傳代擴(kuò)增，即為單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞。

注：培養(yǎng)的第一周不要換液，接下來每3-4天換液。

B、平板挑取法

a.計(jì)數(shù)100個(gè)多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞，接種于一個(gè)10cm培養(yǎng)盤中；

注：盡量吹打均勻，防止細(xì)胞聚團(tuán)。

b.過夜培養(yǎng)后，觀察并尋找單個(gè)細(xì)胞的位置，并在盤底做標(biāo)記；

c.培養(yǎng)2周；

注：培養(yǎng)的第一周不要換液，接下來每3-4天換液。

d.待標(biāo)記處的細(xì)胞擴(kuò)增為肉眼可見的白點(diǎn)，使用10微升移液器，調(diào)至最大量程，在尖端吸取一點(diǎn)胰酶（約5微升，且尖端為空氣），緩慢滴至白點(diǎn)處，保持槍尖靜置在白點(diǎn)上，且不讓胰酶留出白點(diǎn)所在范圍，1min后，迅速吹打，將消化下的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板中，傳代擴(kuò)增，即為單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞。約需2-3周。

注：每盤選取20個(gè)為宜，在消化時(shí)，需按照先消化邊緣的，再消化中心的原則，防止克隆之前的相互污染。培養(yǎng)的第一周不要換液，接下來每3-4天換液。

 

備注：維真生物公司致力于為廣大科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的病毒包裝服務(wù)，服務(wù)項(xiàng)目包括：科研級(jí)和臨床級(jí)腺病毒、慢病毒、腺相關(guān)病毒（AAV）的包裝、質(zhì)粒載體構(gòu)建、TALEN 基因敲除、基因突變等。目前為止公司已經(jīng)擁有人源現(xiàn)貨質(zhì)粒庫（18 000個(gè)）、腺病毒現(xiàn)貨庫（12 000個(gè)）、腺相關(guān)病毒（AAV）現(xiàn)貨庫，公司還擁有豐富的定制服務(wù)項(xiàng)目。真誠歡迎您咨詢與選購！