瓊脂糖凝膠電泳的原理及實(shí)驗(yàn)過程
實(shí)驗(yàn)原理
瓊脂糖凝膠電泳常用于分離、鑒定 DNA、RNA 分子混合物，以瓊脂凝膠作為支持物，利用 DNA 分子在電場中時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。DNA 分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場中由陰極向陽極運(yùn)動(dòng)。在一定的電場強(qiáng)度下，忽略DNA分子攜帶的電荷，DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA 分子的遷移速度與相對(duì)分子量成反比。
不同構(gòu)型的 DNA 分子的遷移速度不同。如環(huán)形 DNA 分子樣品，其中有三種構(gòu)型的分子：超螺旋分子（cccDNA）、開環(huán)分子(ocDNA)、和線形 DNA 分子(IDNA)。這三種不同構(gòu)型分子進(jìn)行電泳時(shí)的遷移速度大小順序?yàn)?cccDNA＞IDNA＞ocDNA。
核酸電泳通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種介質(zhì)。瓊脂糖是一種聚合鏈線性分子；聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺（Acr）在 N,N,N′-四甲基乙二胺（TEMED）和過硫酸銨（AP）的催化下聚合形成長鏈，并通過交聯(lián)劑 N,N′-亞甲雙丙烯酰胺（Bis）交叉連接而成。瓊脂糖凝膠適合分離200bp至近50kb的DNA片段，而聚丙烯酰胺凝膠對(duì)于小片段（5bp-500bp）的分離效果最好，且分辯力極高。選擇不同濃度的凝膠，可以分離丌同大小范圍的 DNA 分子。電場強(qiáng)度愈大，帶電顆粒的運(yùn)動(dòng)赹快。但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而減小，所以電泳時(shí)一般采用低電壓，不超過 6V/cm。而對(duì)于大片段電泳，可以選擇 0.5-1.0V/cm 電泳過夜。如果選擇高電壓電泳，可使用聚丙烯酰胺凝膠。
核酸電泳常采用 TAE、TBE、TPE 三種緩沖系統(tǒng)。TAE 價(jià)格低廉，但緩沖能力低。TPE 在進(jìn)行 DNA 回收時(shí)，會(huì)使 DNA 污染磷酸鹽，影響后續(xù)反應(yīng)。所以綜合考慮，多采用 TBE 緩沖液。
核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠（EB）。溴化乙錠是一種扁平分子，可以嵌入核酸雙鏈的配對(duì)堿基之間。在紫外線照射 BE-DNA 復(fù)合物時(shí)，通過發(fā)光指示核酸的位置。由于EB有較強(qiáng)的揮發(fā)性和毒性，現(xiàn)在大多選擇EB替代品進(jìn)行試驗(yàn)，比較常用的有g(shù)elred，goldview，ybr-green等，但是整體效果都若于傳統(tǒng)的EB。
材料、試劑及器具
1、材料
合適的Marker（分子量標(biāo)準(zhǔn)）；DNA 樣品
2、試劑
加樣緩沖液（6x或10x）；瓊脂糖；溴化乙錠（EB）。
3、器具
（1）電泳系統(tǒng)：電泳儀、水平電泳槽、制膠板等。
（2）凝膠成像系統(tǒng)或紫外透射儀。
實(shí)驗(yàn)過程
1、按所分離的 DNA 分子的大小范圍，選擇合適的比例的凝膠，稱取適量的瓊脂粉，放到一錐形瓶中，加入適量的 TBE電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至瓊脂粉完全溶化，溶液透明。稍搖勻，得膠液。待膠液卻至 60℃左右，在膠液內(nèi)加入適量的比例的溴化乙錠液。
2、水平放置膠槽，在一端插好梳子，在槽內(nèi)緩慢倒入已況至 60℃左右的膠液，使之形成均勻水平的膠面。
3、待膠凝固后，小心拔起梳子，使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電泳槽內(nèi)。
4、在槽內(nèi)加入TBE電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面。
5、把待檢樣品，按合適比例與加樣緩沖液混勻，用移液槍加至凝膠的加樣孔中。
6、接通電泳儀和電泳槽，并接通電源，調(diào)節(jié)合適電壓，穩(wěn)壓輸出，開始電泳。
7、觀察溴酚蘭的帶（藍(lán)色）的位置。當(dāng)其移動(dòng)至約凝膠長2/3處時(shí)，可停止電泳。
8、在紫外透視儀的樣品臺(tái)上重新鋪上一張保鮮膜，趕去氣泡平鋪，然后把凝膠放在上面。關(guān)上樣品室外門，打開紫外燈（360nm 或 254nm），通過觀察孔進(jìn)行觀察。
注意事項(xiàng)
1、電泳中使用的溴化乙錠（EB）為中度毒性、強(qiáng)致癌性物質(zhì)，務(wù)必小心，勿沾染于衣物、
皮膚、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在專門電泳區(qū)域操作，戴一次性手套，并及時(shí)更換。
2、預(yù)先加入EB 時(shí)可能使 DNA 的運(yùn)動(dòng)速度下降15%左右，且不同構(gòu)型的 DNA 的影響程度不同。所以為取得較真實(shí)的電泳結(jié)果可以在電泳結(jié)束后再用 0.5μg/ml 的 EB 溶液浸泡染色。EB在光照下易降解，若凝膠放置一段時(shí)間后才觀察，即使原來膠內(nèi)或樣品已加 EB，建議選擇EB溶液浸泡染色。
3、加樣進(jìn)膠時(shí)不要形成氣泡，需在凝膠液未凝固之前及時(shí)清除，否則，需重新制膠。
4、電泳時(shí)溴酚蘭在瓊脂糖凝膠中的運(yùn)動(dòng)速度可以用于參考電泳速度，已實(shí)際電泳條帶運(yùn)動(dòng)速度為準(zhǔn)。
常見問題分析
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常見問題 |
原因 |
對(duì)策 |
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DNA條帶模糊 |
DNA降解 |
實(shí)驗(yàn)過程避免核酸酶污染 |
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電泳緩沖液陳舊 |
電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，PH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。TBE建議使用10次就更換緩沖液 |
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所用電泳條件不合適 |
電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過6V/CM，溫度＜30℃，巨大DNA鏈電泳，溫度應(yīng)＜15℃，核查所用電泳緩沖液的緩沖能力，注意經(jīng)常更換 |
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DNA上樣量過多 |
減少凝膠中DNA上樣量 |
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DNA含鹽過高 |
電泳前通過乙醇沉淀去除多余鹽分 |
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有蛋白污染 |
電泳前酚抽提去除蛋白 |
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DNA變性 |
電泳前勿加熱，用TE緩沖液稀釋DNA |
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出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 |
PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往PCR體系需要優(yōu)化，PCR程序需要摸索。 |
其對(duì)策有：調(diào)整PCR體系和PCR程序，摸索出合適的條件。 |
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不規(guī)則DNA帶遷移 |
電泳條件不合適 |
電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過6V/CM，溫度＜30℃，巨大DNA鏈電泳，溫度應(yīng)＜15℃，核查所用電泳緩沖液的緩沖能力，注意經(jīng)常更換 |
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DNA變性 |
電泳前勿加熱，用TE緩沖液稀釋DNA |
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帶弱或無DNA帶 |
DNA上樣量不夠 |
增加DNA上樣量，聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度高，上樣量可適當(dāng)降低 |
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DNA降解 |
實(shí)驗(yàn)過程避免核酸酶污染 |
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DNA跑出凝膠 |
縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度 |
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EB染色的DNA，所用光源不合適 |
應(yīng)用短波長（254nm）的紫外光源 |
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DNA帶缺失 |
DNA跑出凝膠 |
縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度 |
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分子大小相近的DNA帶不易分辨 |
增加電泳時(shí)間，核準(zhǔn)正確凝膠濃度 |
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DNA變性 |
電泳前勿加熱，用20mM Nacl 緩沖液稀釋DNA |
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DNA鏈巨大，常規(guī)凝膠電泳不合適 |
在脈沖凝膠電泳上分析 |
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電泳時(shí)Ladder扭曲 |
配膠的緩沖液和電泳緩沖液不是同時(shí)配置 |
同時(shí)配置，電泳緩沖液高出液面1-2mm即可 |
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電泳時(shí)電壓過高 |
電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過6V/CM |
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