實(shí)驗(yàn)原理：

抗體和抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性，免疫組織化學(xué)正是利用了這一原理。先將組織或細(xì)胞中的某種化學(xué)物質(zhì)提取出來，以此作為抗原或半抗原，通過免疫動(dòng)物后獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測(cè)組織或細(xì)胞中的同類的抗原物質(zhì)。由于抗原與抗體的復(fù)合物是無色的，因此還必須借助于組織化學(xué)的方法將抗原抗體結(jié)合的部位顯示出來，以其達(dá)到對(duì)組織或細(xì)胞中的未知抗原進(jìn)行定性，定位或定量的研究。

實(shí)驗(yàn)材料：

（一）儀器設(shè)備

18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐、水浴鍋

（二）試劑

1、PBS緩沖液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L、KCl 2.7mmol/L 、Na2HPO4 4.3mmol/L、KH2PO4 1.4mmol/L。

2、0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液（CB,ph6.0,1000ml）：檸檬酸三鈉3g、檸檬酸0.4g。3、0.5mol/L EDTA緩沖液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226；2H2O，用10mmol/L NaOH調(diào)至ph8.0，加水至1000ml。

4、1mol/L的TBS緩沖液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調(diào)至ph8.0, 加水1000ml。

5、 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

6、3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

7、風(fēng)裱劑：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（ph9.0–9.5）等量混合b 油和TBS(PBS)配制

8、TBS/PBS PH9.0–9.5，適用于熒光纖維鏡標(biāo)本；ph7.0-7.4適合光學(xué)纖維標(biāo)本。

實(shí)驗(yàn)步驟：

（一）脫蠟和水化：

脫蠟前應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。

1、 組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后在浸泡10分鐘。

2、無水乙醇中浸泡五分鐘。

3、 95%乙醇中浸泡五分鐘。

4、75%乙醇中浸泡五分鐘。

（二）抗原修復(fù)：

用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片：

1、抗原熱修復(fù)

（1）高壓熱修復(fù)在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m檸檬酸鈉緩沖溶液（ph6.0）。蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色加上，緩慢加壓，是玻片在緩沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會(huì)升起來。10分鐘后除去熱源，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測(cè)或核抗原的抗原修復(fù)。

（2）沸熱修復(fù)電爐或水浴鍋加熱0.01檸檬酸鈉緩沖液（ph6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10-15分鐘。

（3）微波爐加熱在微波爐里加熱0.01檸檬酸鈉緩沖液（ph6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5-10分鐘，反復(fù)1-2次。適用的抗原Bcl-2、ax、AR、PR、C-fos、x-jum、z-kit、c-myc、E-cadherin。ChromograninA、Cyclin、ER、Heatshock、Protein、HPV、Ki-67、MDMZ、P53、P34、P15、P-glycoprotein、PKC、PCNA、ras、Rb等

2、酶消化方法

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱37℃，消化時(shí)間約為5-30分鐘。適用于被固定遮蔽的抗原：包括Collagen、GFAP、Complement、Cytokeratin、C-erB-2、LCA、LN等。

（三）免疫組化染色SP法

1、脫蠟、水化。

2、PBS洗2-3次各5分鐘。

3、3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘。

4、PBS洗2-3次各5分鐘。

5、抗原修復(fù)。

6、PBS洗2-3次各5分鐘。

7、滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體。

8、滴加Ι抗50μl,室溫靜置1小時(shí)或4℃過夜或37℃1小時(shí)。

9、4℃過夜后需在37℃復(fù)溫45分鐘。

10、PBS洗3次每次2分鐘。

11、滴加Ⅱ抗45-50μl,室溫靜置或37℃1小時(shí)。

12、Ⅱ抗中可加入0.05%的tween-20。

13、PBS洗3次各5分鐘。

14、DAB顯色5-10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度。

15、PBS或自來水沖洗10分鐘。

16、蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化。

17、自來水沖洗10-15分鐘。

18、脫水、透明、封片、鏡檢。

（四）SABC法

1、脫蠟、水化 。

2、PBS洗2次各5分鐘。

3、用蒸餾水或PBS配制新鮮的3%H2O2，室溫封閉5-10分鐘，用蒸餾水洗3次（4）抗原修復(fù)。

4、PBS洗5分鐘。

5、滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體。

5、滴加Ι抗50μl,室溫靜置1小時(shí)或4℃過夜或37℃1小時(shí)。

6、PBS洗3次各2分鐘。

7、滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分鐘。

8、PBS洗3次各2分鐘。

9、滴加試劑SABC 20℃-30℃ 20分鐘。

10、PBS洗4次各5分鐘。

11、DAB顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色。

12、脫水、透明、封片、鏡檢。

免疫組化問題解答

1、染色過強(qiáng)

 a 抗體濃度過高戒孵育時(shí)間過長(zhǎng) 。降低抗體滴度、抗體孵育時(shí)間：室溫1小時(shí)、或4度過夜

 b 孵育溫度過高超過37度。 一般在室溫20-28度 c DAB顯色時(shí)間過長(zhǎng)戒濃度過高 顯色時(shí)間不超過5-12分鐘，以顯微鏡下觀察為準(zhǔn)。

2、非特異性背景染色

a 操作過程中沖洗不充分 ：每步?jīng)_洗3次每次5分鐘。

b 組織中含過氧化物酶未阻斷：可再配置新鮮3%H2O2封閉孵育時(shí)間延長(zhǎng)。

c 組織中含內(nèi)原性生物素：正常非免疫動(dòng)物血清再封閉。

d 血清蛋白封閉不充分：延長(zhǎng)血清蛋白封閉時(shí)間。

3、染色弱

a 抗體濃度過低、孵育時(shí)間過短：提高抗體濃度、孵育時(shí)間不能少于60分鐘。

b 試劑超過有效使用時(shí)間：應(yīng)更換試劑。

c 操作中添加試劑時(shí)緩沖液未瀝干：每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液使試劑稀釋（應(yīng)防止切片干燥）。

d 室溫太低：低于15度，要改放在37度孵育箱孵育30-60分鐘，或4度冰箱過夜。

e蛋白封閉過度：封閉不要超過12分鐘。

4、染色陰性

a 操作步驟錯(cuò)誤：應(yīng)重試、設(shè)陽性對(duì)照。

b 組織中無抗原：設(shè)陽性對(duì)照以驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果。

c 一抗不二抗種屬連接錯(cuò)誤：仔細(xì)確定一抗二抗種屬無誤。

 

免疫組化操作要點(diǎn)及技巧

1、固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。對(duì)于冰凍切片，甲醛固定有時(shí)比冰凍丙酮好；但對(duì)于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。 有時(shí)候商品化的抗體會(huì)有比較適合而推薦的固定液，請(qǐng)于購置前注意說明書。

Bouin S固定液：飽和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其對(duì)組織的穿透力較強(qiáng)，固定較好，結(jié)構(gòu)完整，但因偏酸，對(duì)抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標(biāo)本的長(zhǎng)期保存。

PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。

2、組織脫水，透明：時(shí)間不能太長(zhǎng)，否則在切片時(shí)容易碎片，切不完整。

3、切片時(shí)展片：有些組織在切片后難以在水中展開，這時(shí)可適當(dāng)?shù)卦谒�中加入幾滴乙醇�?/p>

4、烤片：60℃ 30分鐘戒37℃ 過夜，溫度太高或時(shí)間太長(zhǎng)，抗原容易丟失。

5、蠟塊及切片的保存：最好在4℃保存 。

6、脫片問題：

Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中最常用的一種防脫片劑，6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干，即可進(jìn)行下一步。

7、滅活內(nèi)源性酶：HRP系統(tǒng)：3%雙氧水滅活；AP系統(tǒng)：3%HAc滅活。

8、暴露抗原：對(duì)于石蠟切片的免疫組化實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須采用高溫加熱抗原修復(fù)，這將有助于暴露抗原決定簇，從而增加免疫組化染色的強(qiáng)度(不同抗體的最佳修復(fù)液請(qǐng)參閱抗體說明書)。對(duì)不同組織，不同抗原，不同的抗體，所采用的方法應(yīng)不一樣，可進(jìn)行熱修復(fù)、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。

9、封閉：在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強(qiáng)時(shí)，可延長(zhǎng)封閉時(shí)或用濃縮血清封閉

10、抗體稀釋：應(yīng)遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配”的原則，對(duì)亍PBS稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用。

11、背景高：在抗體濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特別是在顯色前要多洗。

12、返藍(lán)：在蘇木素復(fù)染后，可用堿性緩沖液（如PBS）戒Na2HPO4的飽和溶液返藍(lán)。

13、顯色：一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景。

14、在整個(gè)操作過程中，切片千萬不能干燥，否則會(huì)有非特異性染色。

15、拍照

1)更換樣品時(shí)，除了調(diào)整焦距和規(guī)野外，顯微鏡上的其他部件都不能動(dòng)！所有樣品必須一次拍攝完全。特別是在拍攝過程中，不要一會(huì)用高倍鏡，一會(huì)用低倍鏡，來回切換物鏡。

2)數(shù)碼相機(jī)必須設(shè)置為手動(dòng)曝光，并且保持每張照片用同樣的曝光條件，同樣的曝光時(shí)間，同樣的光圈。特別要注意的是，一定要將數(shù)碼相機(jī)的自動(dòng)白平衡功能給關(guān)掉 。

3)免疫組化切片一般染色不太深，因此拍攝出的照片顏色較淺，就讓它淺。拍攝出的照片中空白部位應(yīng)盡可能呈現(xiàn)純白色。測(cè)量其灰度應(yīng)在250左右。如果呈現(xiàn)淡藍(lán)色，一般是相機(jī)自動(dòng)白平衡在起作用。另外一個(gè)因素是顯微鏡燈光電壓不正確。要使燈光本身的色溫正確。既不偏黃，也不偏藍(lán)。

免疫組化技術(shù)的關(guān)鍵問題

1.組織處理

恰當(dāng)?shù)慕M織處理是做好免疫組化染色的先決條件，也是決定染色成敗的內(nèi)部因素，在組織細(xì)胞材料準(zhǔn)備過程中，不僅要求保持組織細(xì)胞形態(tài)完整，更要保持組織細(xì)胞的抗原性不受損戒彌漫，防止組織自溶。如果出現(xiàn)自溶壞死的組織，抗原已經(jīng)丟失，即使用很靈敏的檢測(cè)抗體和高超的技術(shù)，也很難檢出所需的抗原，反而往往由于組織的壞死及制片時(shí)的刀痕擠壓，在上述區(qū)域易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

1) 組織及時(shí)取材和固定

組織標(biāo)本及時(shí)的取材和固定是做好免疫組化染色的關(guān)鍵第一步，是有效防止組織自溶壞死，抗原丟失的開始，離體組織應(yīng)盡快的進(jìn)行材，最好2h內(nèi)，取材時(shí)所用的刀應(yīng)銳利，要一刀下去切開組織，不可反復(fù)切拉組織，造成組織的擠壓，組織塊大小要適中，一般在2.5cm×2.5cm×0.2cm，切記取材時(shí)組織塊寧可面積大，千萬不能厚的原則，(也就是說組織塊的面積可以大到3cm×5cm，但組織塊厚度千萬不能超過0.2cm，否則將不利于組織的均勻固定)。固定液快速滲透到組織內(nèi)部使組織蛋白能在一定時(shí)間內(nèi)迅速凝固。從而完好的保存抗原和組織細(xì)胞形態(tài)。

對(duì)亍固定液的選擇，原則上講，應(yīng)根據(jù)抗原的耐受性來選擇相應(yīng)的固定液，但除非是與項(xiàng)科研項(xiàng)目，在病理常見工作很難做到這一點(diǎn)，因?yàn)椴±淼脑\斷和鑒別診斷都是在常見HE病理診斷的基礎(chǔ)上決定是否進(jìn)行免疫組化的染色，而HE染色的常見組織處理是采用10%的中性緩沖福爾馬林或4%緩沖多聚甲醛4倍于組織體積進(jìn)行組織固定，利用其滲透性強(qiáng)，對(duì)組織的作用均勻進(jìn)行固定，但組織固定時(shí)間最好在l2h內(nèi)，一般固定時(shí)間不應(yīng)超過24小時(shí)。隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)組織抗原的檢出強(qiáng)度將逐漸降低。

2) 組織脫水、透明、浸蠟

組織經(jīng)固定后迚行脫水、透明、浸蠟和包埋。掌握的原則是脫水透明要充分但不能過，浸蠟時(shí)間要夠，溫度不能高，否則造成組織的硬脆使組織切片困難，即使能切片，由于組織癿硬脆，也使切片不能完好平整，染色過程中極易脫片，對(duì)免疫組化染色抗原的定位及背景都不利，所以無水酒精脫水和二甲苯透明的時(shí)間不宜過長(zhǎng)，正常大小的組織無水酒精脫水lh×3次，二甲苯透明lh×2次即可，浸蠟及包埋石蠟溫度不要超過65℃。

2.切片

組織得到很好處理后在進(jìn)行切片前還應(yīng)對(duì)玻璃片進(jìn)行處理，由亍我們檢測(cè)抗原是多種多樣的，因染色操作程序復(fù)雜，時(shí)間較長(zhǎng)，有些抗原是要進(jìn)行各種抗原修復(fù)處理，如微波、高壓、水溶酶等，玻片如果得不到很好的處理，將易造成脫片，為保證克免疫組化實(shí)驗(yàn)的正常迚行，要求在貼片前對(duì)載玻片作適當(dāng)處理，必須在清洗干冷的玻片上進(jìn)行粘合劑癿處理以防脫片。

1)Poly-L-Lysine (多聚左旋賴氨酸) 一般采用分子量30000左右癿0.5%多聚賴氨酸最好，也可用試劑公司出售的其濃溶液以1：10去離子水稀釋。方法是將玻片浸泡其中，傾盡余液，在60℃溫箱中烤干備用，此方法的優(yōu)點(diǎn)是可以用于多種組織化學(xué)、免疫組化及分子學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用，粘貼效果最好，但價(jià)格稍貴。

2)明膠硫酸鉻鉀法

將2.5g明膠加熱溶亍500ml蒸餾水中，完全溶解冷卻后加入0.25g硫酸鉻鉀攪勻充分溶解即可使用。方法是將玻片浸泡其中2 min，取出控盡液體入溫箱中烤干備用。此法價(jià)格便宜、方法簡(jiǎn)單，任何實(shí)驗(yàn)都可以使用，特別適用于大批量的使用，但應(yīng)注意，如果液體發(fā)藍(lán)戒粘稠狀停用。

3)APES (3-氨丙基-乙氧基甲硅烷)

此法必須現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗冷玻片入1:50丙酮稀釋的APES中，浸泡20s，取出稍停再入丙酮戒蒸餾水中刷去末結(jié)合的APES晾干即可。用此方法粘合的玻片應(yīng)垂直烤片不能平拷，否則組織片中易出現(xiàn)氣泡。

切片必須保持切片刀銳利，切片要薄而平整、無皺摺、無刀痕，如有上述問題的切片在進(jìn)行免疫組化染色都將出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，切片厚度一般為3-4μm，切好的切片在60℃溫箱中過夜，注意烤片的溫度不宜過高，否則易使組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，而產(chǎn)生抗原標(biāo)記定位彌漫現(xiàn)象。

3.免疫組化染色

S-P免疫組化染色試劑盒采用生物素標(biāo)記癿第二抗體不鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及底物色素混合液來測(cè)定細(xì)胞和組織中的抗原。

S-P免疫組化染色步驟：

石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS(pH7．4)沖洗三次，每次3分鐘(3×3’)。

2) 根據(jù)每一種抗體的要求，對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。

3) 每張切片加1滴或50ul過氧化酶阻斷溶液(試劑A)，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育10分鐘。

4) PBS沖洗3×3’。

5) 甩去PBS液，每張切片加1滴或50ul的非免疫性動(dòng)物血清(試劑B)，室溫下孵育10分鐘。

6) 甩去血清，每張切片加1滴或50ul的第一抗體(用戶自選)，室溫下孵育60分鐘戒4℃過夜，建議參閱每種抗體的說明書。

7) PBS沖洗3×5’。

8) 甩去PBS液，每張切片加1滴或50ul生物素標(biāo)記的第二抗體（試劑C），室溫下孵育10分鐘。

9) PBS沖洗3×3’。

10)甩去PBS液，每張切片加1滴或50ul鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10分鐘。

11)PBS沖洗3×3’。

12)甩去PBS液，每張切片加2滴或100ul新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3-10分鐘，陽性顯色為棕色或紅色。

13)自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.1％HCL分化，0.1％氨水或PBS沖洗返藍(lán)。

14)如果用DAB顯色，則切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，(二甲苯透明)，中性樹膠封固；如果用AEC顯色，則切片不能經(jīng)酒精脫水，而直接用水性封片劑封片。

免疫組化染色注意事項(xiàng)

免疫組化染色方法已不是什么很難的問題，操作步驟簡(jiǎn)單也易掌握，但要染好免疫組化，其中方法的技巧將是每位操作者在實(shí)際工作中不斷摸索和探討的事，但最基本的應(yīng)從以下方面加以注意：

（1）去除內(nèi)源酶及內(nèi)源性生物素

一般我們進(jìn)行免疫組化標(biāo)記的都是一些生物體組織，其中自身含有一定量的內(nèi)源酶和內(nèi)源性生物素，而免疫組化各種染色大部分是用過氧化物酶來標(biāo)記抗體癿，酶的作用是催化底物，使顯色劑顯色，而組織中的內(nèi)源性酶同樣也能催化底物，使其顯色，這就影響免疫組化的特異性，所以在標(biāo)記抗體的過氧化酶進(jìn)行人組織切片之前就應(yīng)設(shè)法將組織內(nèi)的內(nèi)源性各種酶滅活，以保證免疫組化染色在特異性情況下進(jìn)行。

1) 去除內(nèi)源酶

常用的去除內(nèi)源性酶的方法是3%過氧化氫水溶液。但在含有豐富血細(xì)胞的標(biāo)本中，由于其中含有大量的具有活性的過氧化物酶，能不過氧化氫反應(yīng)，出現(xiàn)氣泡現(xiàn)象，易對(duì)組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生一些不良影響，但用3%過氧化氫的方法，能夠去除大部分內(nèi)源性酶，即使有些血細(xì)胞在顯色后也出現(xiàn)棕黃色反應(yīng)，但由于其形態(tài)結(jié)構(gòu)不組織細(xì)胞不同，也易鑒別，而此方法比較通用易操作，但應(yīng)注意過氧化氫的濃度不能過高，一般為3%一5%，時(shí)間不宜過長(zhǎng)，最好室溫10min。

2) 去除內(nèi)源性生物素

在正常組織細(xì)胞中也含有生物素，特別是肝、脾、腎、腦，皮膚等組織中，在應(yīng)用親和素試劑的染色中，內(nèi)源性生物素易結(jié)合卵白素，形成卵白素一生物素復(fù)合物，導(dǎo)致假陽性，所以在采用生物素方法染色前也可以將組織切片進(jìn)行0.01%卵白素溶液室溫處理20min，使其結(jié)合位點(diǎn)飽和，以消除內(nèi)源性生物素的活性。

3）滅活堿性磷酸酶

最常用的方法是將左旋咪挫(以每毫升加24mg)加入底物液中并保持pH值為7.6-8.2，能除去大部分內(nèi)源性堿性磷酸酶，對(duì)亍仍能干擾染色的酸性磷酸酶可用0.05mo1/L酒石酸抑制。

（2）抑制非特異性背景著色

非特異性著色最常見的情況是抗體吸附到組織切片中高度荷電的膠原和結(jié)締組織成分上，而出現(xiàn)背景著色，為了防止這種現(xiàn)象，最好用特異性抗體來源的同種動(dòng)物滅活的非免疫血清在特異性抗體之前進(jìn)行處理，以封閉荷電點(diǎn)，不讓一抗結(jié)合，但這種方法一般實(shí)驗(yàn)室很難實(shí)現(xiàn)，一般常見實(shí)用的血清是2%-10%羊血清或2%牛血清白蛋白在室溫下作用10-30min即可，但應(yīng)注意此種結(jié)合是不牢固結(jié)合，所以最好不要沖洗，傾去余液直接加一抗，對(duì)于多余的隆抗體來講，易產(chǎn)生背景著色，在稀釋特異性抗體時(shí)可采用含1%非免疫血清的pH7.4的PBS液。

（3）緩沖液

免疫組化染色標(biāo)記是對(duì)生物體組織抗原進(jìn)行標(biāo)記，抗原抗體最合適的pH值為7.2-7.6，最常用的是0.0l mol / LpH7.4磷酸緩沖液(PBS)。簡(jiǎn)易配法：5000ml蒸餾水中分別加入l g NaH2PO4、15.6gNa2HPO4 、42.5gNaCl。但如果是采用堿性磷酸酶(AP)作為標(biāo)記物底物的方法時(shí)可以用0.02mol/L TBS pH8.2緩沖液比較好。

（4）抗原修復(fù)

經(jīng)甲醛固定的部分組織細(xì)胞，可使免疫組化標(biāo)記敏感性明顯降低，這是因?yàn)榧兹┕潭ㄟ^程中形成醛鍵或保存的甲醛會(huì)形成羧甲基而封閉部分抗原決定簇。因此，在染色時(shí)，有些抗原需先進(jìn)行修復(fù)或暴露。

抗原修復(fù)方法可分為化學(xué)方法和物理方法。化學(xué)方法是以酶消化方法，常用胰蛋白酶及胃蛋白酶，配制濃度不消化時(shí)間要適度。常用癿物理方法有單純加熱、微波處理和高壓加熱。

在選用這三種加熱法時(shí)，浸泡切片癿緩沖液的離子強(qiáng)度和PH值、加熱的溫度和時(shí)間均影響著抗原修復(fù)效果。目前最常用的修復(fù)方法有如下凡種：

1）胰蛋白酶(Trpsin)

主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的修復(fù)。一般使用濃度為0.1%，37℃作用10min。配法：0.1g胰蛋白酶加入到0.1%pH7.8CaCl2(無水)水溶液中溶解后即可。

2）胃蛋白酶(Pepsin)主要用于細(xì)胞間質(zhì)或基底膜抗原的修復(fù)。一般濃度為0.4%，37℃作用30min。配法：0.4g胃蛋白酶溶于0.lmol/L HCl水溶液中。

3）熱引導(dǎo)的抗原決定簇修復(fù)(Heat Induced Epitope Retrieval，HIER)

HIER對(duì)大多數(shù)的抗體有益，尤其是對(duì)核抗原的修復(fù)作用更加明顯，最常用的抗原修復(fù)液是pH6.0的檸檬酸緩沖液和pH8.0癿EDTA緩沖液，它們的作用原理是通過鈉離子的螯合而實(shí)現(xiàn)的�？乖�修復(fù)液的pH值非常重要，有效的抗原修復(fù)pH值要比修復(fù)液的化學(xué)成分。

更重要，同樣的修復(fù)液隨著pH值的升高染色的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，但最佳pH值范圍為6.0-10.0，對(duì)于大多數(shù)抗原這個(gè)范圍癿pH值都能進(jìn)行有效的修復(fù)，有些抗體(如Ki-67、ER)則在pH值l.0-3.0和6.0-8.0更為有效。作為通用修復(fù)液堿性pH值的修復(fù)液要比酸性的有效，而對(duì)固定很長(zhǎng)時(shí)間舊的存檔組織，酸性pH值的修復(fù)液則優(yōu)亍堿性的修復(fù)液，所以兩種抗原修復(fù)液可作為相互替補(bǔ)的進(jìn)行抗原修復(fù)。在進(jìn)行HIER過程中應(yīng)防止切片的干燥，加熱時(shí)必須達(dá)到預(yù)定的溫度，保溫時(shí)間要足夠，對(duì)于一些不要抗原修復(fù)的抗體最好不要采用HIER處理，否則對(duì)染色無益，但有些抗體則需要利用多種修復(fù)聯(lián)合應(yīng)用。

HIER方法有：

1）水浴加熱法:將脫蠟人水后的切片放人盛有修復(fù)的容器中，放人加熱煮沸水中，當(dāng)修復(fù)液溫度達(dá)到95℃左右時(shí)計(jì)時(shí)l5min，自然冷卻，PBS洗3min×3次。

2)微波加熱法:將切片放入修復(fù)液中微波加熱使溫度在96℃左右，計(jì)時(shí)l0min，在微波爐中停留2min，室溫自然冷卻，PBS洗3min×3次。

3)高壓加熱法:將修復(fù)液在高壓鍋中煮沸，切片插在染色架上，放入鍋中(要使修復(fù)液淹沒切片)開始噴氣時(shí)蓋上壓力閥。計(jì)時(shí)2min，況水沖至室溫取出切片，PBS洗3min×3次。

（5）顯色

免疫組化染色的顯色是最后的關(guān)鍵問題，一般辣根過氧化物酶(HRP)的檢測(cè)系統(tǒng)選用DAB或AEC顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯色。但要得到最佳的顯色效果，必須在鏡下嚴(yán)格控制，以檢出物達(dá)到最強(qiáng)顯色而背景無色為最終點(diǎn)，尤其DAB顯色時(shí)間短著色淺，時(shí)間長(zhǎng)背景又深，都將影響結(jié)果判斷，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)DAB在配制完后最長(zhǎng)宜放置30min以內(nèi)，過時(shí)不能使用，DAB加到組織切片時(shí)作用時(shí)間最長(zhǎng)不宜超過10min(最好在5min內(nèi))，否則不管有無陽性都應(yīng)終止反應(yīng)。對(duì)一些含有內(nèi)源性酶較高的組織用DAB顯色時(shí)極易出現(xiàn)背景色更應(yīng)盡早在鏡下控制，以達(dá)到最佳的分辨效果（棕色）。AEC顯色系統(tǒng)（紅色）的弊端是易溶于有機(jī)溶劑，所以封片時(shí)應(yīng)以水性封片劑為主，同時(shí)染色的切片也不能久存。如果是堿性磷酸酶(AP)最好選用NBT/BCIP作為顯色系統(tǒng)（結(jié)果染為藍(lán)黑色）。

（6）結(jié)果判斷

免疫組化的結(jié)果判斷有兩種方法：

一是對(duì)以檢測(cè)結(jié)果陽性細(xì)胞指數(shù)來定性(如核抗原的標(biāo)記)，判斷方法是以一個(gè)規(guī)野中陽性細(xì)胞數(shù)不總細(xì)胞癿百分比，再取10個(gè)相同視野算取平均指數(shù)。

另一種方法以染色陽性強(qiáng)度和陽性檢出率相結(jié)合而定，一般陽性細(xì)胞數(shù)在0-25為陰性，25-50為十，50-75為十十，75以上為十十十。此種判定方法容易出現(xiàn)人為誤差現(xiàn)象。有條件的實(shí)驗(yàn)室最好能用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)定量分析更為準(zhǔn)確。一切的判定方法都是力求使免疫組化染色結(jié)果判斷更標(biāo)準(zhǔn)，但各單位采取的標(biāo)準(zhǔn)不盡相同，所以判斷標(biāo)準(zhǔn)化問題還有待長(zhǎng)期實(shí)踐中病理學(xué)術(shù)界商討判定標(biāo)準(zhǔn)。

IHC中常見的抗原表達(dá)模式有以下幾種：

1）細(xì)胞漿內(nèi)彌漫性分布，多數(shù)胞漿型抗體的反應(yīng)如此，如細(xì)胞角蛋白(cytokeratin，CK)和波形蛋白(vimentin)等；

2）細(xì)胞核周的胞漿內(nèi)分布，其判別要點(diǎn)是細(xì)胞核的輪廓被勾畫得很清楚，如CD3多克隆抗體的染色；

3）胞漿內(nèi)局限性點(diǎn)狀陽性，如CDl5抗體的染色；

4）細(xì)胞膜線性陽性，大多數(shù)淋巴細(xì)胞標(biāo)記的染色如此，如CD20、CD45RO；

5）細(xì)胞核陽性，如Ki-67及雌、孕激素受體蛋白ER、PR等。一種抗體可同時(shí)出現(xiàn)。

 細(xì)胞漿和細(xì)胞膜的陽性表達(dá)，如EMA可呈膜性和胞漿內(nèi)彌漫性陽性反應(yīng)；CD30抗體可同時(shí)呈膜性和胞漿內(nèi)點(diǎn)狀陽性反應(yīng)等。

（7）對(duì)照片癿設(shè)置

免疫組化的質(zhì)量取決于正確使用各種對(duì)照，沒有對(duì)照的免疫組化結(jié)果是毫無意義的。對(duì)照包括陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和自身對(duì)照。在實(shí)踐中可用染色組織切片中不含抗原的組織作為陰性對(duì)照，而用含抗原的正常組織作陽性對(duì)照，這種自我對(duì)照具有節(jié)約的意義。觀察染色結(jié)果時(shí)，先觀察對(duì)照組織的結(jié)果，如陽性對(duì)照組織中陽性細(xì)胞呈強(qiáng)陽性，陰性對(duì)照細(xì)胞呈陰性，內(nèi)源酶陰性，背景無非特異性染色時(shí)，表明本次實(shí)驗(yàn)的全部試劑和全過程技術(shù)操作準(zhǔn)確無誤，待檢組織中的陽性細(xì)胞也就是可信的正確結(jié)果。 免疫組化染色中對(duì)照片的設(shè)置非常重要，它是判斷您的染色是否成功的關(guān)鍵依據(jù)，而且也是檢測(cè)每一個(gè)抗體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，常設(shè)的對(duì)照如下，一般實(shí)驗(yàn)最常用的只選第二種方法。

1）空白對(duì)照(陰性對(duì)照) 第一抗體由PBS或非免疫血清取代。

2）陽性對(duì)照 用已知含有要檢測(cè)抗原的切片作陽性對(duì)照。

3）回收實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照 已知抗原不相應(yīng)的第一抗體混合，發(fā)生結(jié)合沉淀，再用此沉淀抗體復(fù)合物進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為陰性。

4）替代對(duì)照 用于第一抗體同種動(dòng)物的血清或無關(guān)抗體代替第一抗體結(jié)果為陰性。

5）自身對(duì)照 在同一切片上，應(yīng)將不同組織成分中的陽性戒陰性結(jié)果不檢測(cè)的目的物對(duì)照比較。如actin、CD34在正常組織中的血管壁肌層應(yīng)為陽性，vimentin可以間質(zhì)細(xì)胞，對(duì)照desmin以血管壁及肌束為對(duì)照，S-100蛋白以小神經(jīng)末梢為對(duì)照等，如果應(yīng)為陽性飛組織是陽性，則免疫組化技術(shù)正確，如為陰性，則表明染色技術(shù)有問題或免疫試劑質(zhì)量有問題。

免疫組化染色

一．石蠟切片免疫組化染色實(shí)驗(yàn)步驟：

1．石蠟切片脫蠟至水：（石蠟切片染色前應(yīng)置60℃ 1小時(shí)）。

（1）二甲苯、II，各10分鐘。

（2）梯度酒精：100%，2分鐘® 95%，2分鐘® 80%，2分鐘® 70%，2分鐘。

（3）蒸餾水洗：5分鐘，2次（置于搖床）。

2．過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶：3%H2O2，室溫10分鐘（避光）。

3．蒸餾水洗：5分鐘，2次（置于搖床）。

4．抗原修復(fù)：根據(jù)待檢測(cè)的抗原，選擇適當(dāng)?shù)姆椒ā?/p>

附：抗原修復(fù)液（10mM pH 6.0檸檬酸鈉緩沖液）的配制

（1）儲(chǔ)備液的配制：A液：檸檬酸三鈉-2H2O 29.41g + 蒸餾水1000ml  B液：檸檬酸21g + 蒸餾水1000ml

（2）工作液的配制：A液82ml + B液18ml + 蒸餾水900ml

抗原修復(fù)的方法：

（1）高壓鍋處理技術(shù)：檸檬酸鈉緩沖液（10mM，PH6.0）,淹沒切片,蓋上鍋蓋，高壓鍋內(nèi)煮沸,上汽3分鐘后緩慢冷卻（可用自來水在高壓鍋外沖，以助冷卻）。

（2）微波處理技術(shù)：用塑料切片架，置亍塑料或耐溫玻璃容器內(nèi)，檸檬酸鈉緩沖液淹沒切片，選擇中高或高檔，5分鐘；叏出并補(bǔ)充已預(yù)熱的檸檬酸鈉緩沖液；再選擇中高戒高檔，5分鐘。（最佳溫度為92-95℃）

（3）酶消化處理：此略抗原修復(fù)的注意事項(xiàng)：

1）組織不能干。

2）選擇抗原修復(fù)方法要因抗體而異。

3）該方法主要用亍10%福爾馬林固定、石蠟包埋組織。

4）抗原修復(fù)后至DAB顯色的過程中，均需用PBS緩沖液。

5、PBS：5分鐘，2次（置于搖床）。

6、正常血清封閉：從染片缸中出取切片，擦冷切片背面水分及切片正面組織

周圍的水分（保持組織呈濕潤(rùn)狀態(tài)）,滴加正常山羊戒兔血清（不第二抗體同源動(dòng)物血清）處理，37℃，15分鐘。

附：正常血清配制 (或按試劑盒規(guī)定的濃度配制)

按1:20比例,用PBS配制,每張切片需要量按50ml+5ml (10%拋灑量)計(jì)算。

7、滴加第一抗體：用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加第一抗體，37℃、2小時(shí) 。

（也可置于4℃冰箱過夜）。

8、PBS：5分鐘，2次（置于搖床）。

9、滴加生物素化的二抗，37℃，40分鐘。

10、PBS：5分鐘，2次（置于搖床）。

11、滴加三抗 （SAB復(fù)合物），37℃，40分鐘。

12、PBS：5分鐘，2次（置于搖床）。

13、DAB顯色，鏡下觀察，適時(shí)終止（自來水沖終止）。

附：DAB的配制

（1）儲(chǔ)備液(DAB 25mg/ml)癿配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶解后分裝成1ml,100ul,50ul，20ul等，—20℃，凍存。

（2）工作液：DAB儲(chǔ)備液20ul + PBS 1000ul + 3% H2O2 5ul

14．自來水（細(xì)水）充分沖洗。

15．蘇木素復(fù)染，室溫，30秒，自來水沖洗。

16．自來水沖洗返藍(lán)，15分鐘。

17．梯度酒精脫水：

80%，2分鐘 、95%，2分鐘 、100%，2次，5分鐘。

18．二甲苯透明：

I，II（二甲苯）各5分鐘。

19．封片：加拿大樹膠（或中性樹膠）封片。

二、細(xì)胞爬片的免疫疫組化染色： 1. 取出細(xì)胞爬片，迅速置入冷丙酮固定20-30分鐘。

2. 蒸餾水浸泡5分鐘，2次。

3. 打孔液浸泡5分鐘。

4. 蒸餾水浸泡5分鐘，2次。

5. 后接前述實(shí)驗(yàn)步驟的第6步（正常血清封閉）。

注：第3、4步僅用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原，檢測(cè)細(xì)胞膜抗原時(shí)不用。

三、冰凍切片的免疫組化染色：

1、新鮮組織立即在恒冷冰凍切片機(jī)內(nèi)切片(也可-80℃保存),厚度為5～6mm。

2、載玻片可不打底，裱片后，立即用電吹風(fēng)吹干。

3、如不馬上染色，可密封后-20℃保存。

4、染色前用冷丙酮在4℃固定10-20分鐘。

5、PBS洗2次,每次5分鐘,(必要時(shí)應(yīng)用0.1%檸檬酸鈉+0.1%triton打孔)

6、3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶,20分鐘,避光；

7、用PBS洗2次,每次5分鐘；

8、接前面實(shí)驗(yàn)步驟第六步。

四、載玻片的預(yù)處理：

1、洗衣粉液浸泡30分鐘，沖洗，晾干。

2、洗液 （含強(qiáng)酸、高錳酸鉀等）浸泡24小時(shí)，沖洗，晾干。

3、APES（1:50丙酮溶液）10-20秒（注意：不能用塑料容器及塑料切片架）。

4、純丙酮I，約10秒。純丙酮II，約5秒。

5、晾干或烤箱內(nèi)烤干，備用。

 

備注：維真生物公司致力于為廣大科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的病毒包裝服務(wù)，服務(wù)項(xiàng)目包括：科研級(jí)和臨床級(jí)腺病毒、慢病毒、腺相關(guān)病毒（AAV）的包裝、質(zhì)粒載體構(gòu)建、TALEN 基因敲除、基因突變等。目前為止公司已經(jīng)擁有人源現(xiàn)貨質(zhì)粒庫（18 000個(gè)）、腺病毒現(xiàn)貨庫（12 000個(gè)）、腺相關(guān)病毒（AAV）現(xiàn)貨庫，公司還擁有豐富的定制服務(wù)項(xiàng)目。真誠歡迎您咨詢與選購！