實(shí)驗(yàn)原理：

蛋白質(zhì)含量測(cè)定法，是生物化學(xué)研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四種古老的經(jīng)典方法，即定氮法、雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍使用起來(lái)的新的測(cè)定法，即考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏10～20倍，比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。

值得注意的是，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因?yàn)橐环N蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測(cè)定，有可能得出四種不同的結(jié)果。每種測(cè)定法都不是完美無(wú)缺的，都有其優(yōu)缺點(diǎn)。在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮：①實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度；②蛋白質(zhì)的性質(zhì)；③溶液中存在的干擾物質(zhì)；④測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間�？捡R斯亮藍(lán)法（Bradford法），由于其突出的優(yōu)點(diǎn)，正得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

一、微量凱氏（Kjeldahl）定氮法

樣品與濃硫酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：

CH2COOH-NH2+3H2SO4=2CO2+3SO2+4H2O+NH3    (1)

2NH3+H2SO4=(NH4)2SO4(2)

(NH4)2SO4+2NaOH=2H2O+Na2SO4+2NH3(3)

反應(yīng)（1）、(2)在凱氏瓶?jī)?nèi)完成，反應(yīng)（3）在凱氏蒸餾裝置中進(jìn)行。

為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點(diǎn)。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強(qiáng)酸。實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法這里從略。

計(jì)算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應(yīng)將總氮量減去非蛋白氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6．25即得。

五種蛋白質(zhì)測(cè)定方法比較如下：方法	靈敏度	時(shí)間	原理	干擾物質(zhì)	說(shuō)明
凱氏定氮法 （Kjedahl法）	靈敏度低，適用于0.2~ 1.0mg氮，誤差為±2％	費(fèi)時(shí) 8～10小時(shí)	將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后滴定	非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離）	用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定；干擾少；費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)
雙縮脲法（Biuret法）	靈敏度低 1～20mg	中速 20~30分鐘	多肽鍵＋堿性Cu2＋®紫色絡(luò)合物	硫酸銨； Tris緩沖液； 某些氨基酸	用于快速測(cè)定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似
紫外吸收法	較為靈敏 50～100ug	快速 5～10分鐘	蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收	各種嘌吟和嘧啶； 各種核苷酸	用于層析柱流出液的檢測(cè)；核酸的吸收可以校正
Folin－酚試劑法（Lowry法）	靈敏度高 ～5ug	慢速 40～60 分鐘	雙縮脲反應(yīng)；磷鉬酸－磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原	硫酸銨； Tris緩沖液； 甘氨酸； 各種硫醇	耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)；操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí)； 顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化
考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)	靈敏度最高 1～5ug	快速 5～15分鐘	考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，其lmax由465nm變?yōu)?95nm	強(qiáng)堿性緩沖液； TritonX-100； SDS	最好的方法； 干擾物質(zhì)少； 顏色穩(wěn)定顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化

二、雙縮脲法（Biuret法）

（一）實(shí)驗(yàn)原理

雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱(chēng)為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類(lèi)化合物都有雙縮脲反應(yīng)。

紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。測(cè)定范圍為1-10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。

此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。

（二）試劑與器材

1、試劑：

（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白（BSA）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用BSA濃度1mg/ml的A280為0.66來(lái)校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，計(jì)算出其純度，再根據(jù)其純度，稱(chēng)量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05NNaOH配制。

（2）雙縮脲試劑：稱(chēng)以1.50克硫酸銅（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸鉀鈉

（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀釋到1升，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長(zhǎng)期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。

2. 器材：

可見(jiàn)光分光光度計(jì)、大試管15支、旋渦混合器等。

（三）操作方法

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足到1毫升，然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（20-25℃）下放置30分鐘，于540nm處進(jìn)行比色測(cè)定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照液。取兩組測(cè)定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標(biāo)，光吸收值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2、樣品的測(cè)定：取2-3個(gè)試管，用上述同樣的方法，測(cè)定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意樣品濃度不要超過(guò)10mg/ml。

三、Folin—酚試劑法（Lowry法）

（一）實(shí)驗(yàn)原理

這種蛋白質(zhì)測(cè)定法是最靈敏的方法之一。過(guò)去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現(xiàn)在已可以訂購(gòu)），近年來(lái)逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：

在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。‚Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。

Folin—酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個(gè)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專(zhuān)一性較差，干擾物質(zhì)較多。對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應(yīng)。而且對(duì)后者的影響還要大得多。酚類(lèi)、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類(lèi)、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對(duì)顯色無(wú)影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液，即可顯色測(cè)定。

若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色淺，則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1-2倍。

進(jìn)行測(cè)定時(shí)，加F olin—酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。

此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。

此法可檢測(cè)的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測(cè)定范圍是20-250mg。

（二）試劑與器材

1.試劑

（1）試劑甲：

（A） 10克Na2CO3，2克NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O）。溶解于500毫升蒸餾水中。

（B） 0.5克硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份（A）與1份（B）混合，即為試劑甲。

（2）試劑乙：

在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）,25克鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時(shí)，回流結(jié)束時(shí)，加入150克硫酸鋰（Li2SO4），50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開(kāi)口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過(guò)量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升，過(guò)濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋?zhuān)�約加水1倍，使最終的酸濃度為1N左右。

（3）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:

精確稱(chēng)取結(jié)晶牛血清清蛋白或g—球蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9%NaCl溶液。

2. 器材

（1）可見(jiàn)光分光光度計(jì)

（2）旋渦混合器

（3）秒表

（4）試管16支

（三）操作方法

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（濃度為250mg/ml）。用水補(bǔ)足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（20～25℃）放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙（Folin—酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會(huì)使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照，于700nm處測(cè)定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，繪制注意：因Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開(kāi)始計(jì)時(shí)，1分鐘后，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類(lèi)推。全部試管加完試劑甲后若已超過(guò)10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管，余此類(lèi)推。待最后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘，然后開(kāi)始測(cè)定光吸收。每分鐘測(cè)一個(gè)樣品。

進(jìn)行多試管操作時(shí)，為了防止出錯(cuò)，每位學(xué)生都必須在實(shí)驗(yàn)記錄本上預(yù)先畫(huà)好下面的表格。表中是每個(gè)試管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。最下面兩排是計(jì)算出的每管中蛋白質(zhì)的量（微克）和測(cè)得的吸光度值。

Folin—酚試劑法實(shí)驗(yàn)表格：

管號(hào)1    2    3    4    5    6    7    8    9   10

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)0 0.10.20.40.60.81.0 （250mg/ml） 未知蛋白質(zhì)0.2   0.4  0.6 （約250mg/ml） 蒸餾水1.0 0.9  0.8  0.6  0.4 0.2 00.8  0.6   0.4 試劑甲5.0 5.0  5.0  5.0  5.0  5.0 5.0  5.0  5.0   5.0 試劑乙0.5 0.50.50.50.50.50.50.50.50.5

每管中蛋白質(zhì) 的量（mg） 吸光度值（A700）

2. 樣品的測(cè)定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì)20-250微克），按上述方法進(jìn)行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照。通常樣品的測(cè)定也可與標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定放在一起，同時(shí)進(jìn)行。即在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的各試管后面，再增加3個(gè)試管。如上表中的8、9、10試管。

根據(jù)所測(cè)樣品的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從而計(jì)算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。

注意，由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測(cè)定法通常只適用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度（相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。

四、改良的簡(jiǎn)易Folin—酚試劑法

（一）試劑

1. 試劑甲：堿性銅試劑溶液中，含0.5N NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸鉀和0.05%硫酸銅，配制時(shí)注意硫酸銅用少量蒸餾水溶解后，最后加入。

2. 試劑乙：與前面的基本法相同。臨用時(shí)加蒸餾水稀釋8倍。

3. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：同基本法。

 

（二）操作步驟

測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品溶液的操作方法與基本法相同。只是試劑甲改為1毫升，室溫放置10分鐘后，試劑乙改為4毫升。在55℃恒溫水浴中保溫5分鐘。用流動(dòng)水冷卻后，在660nm下測(cè)定其吸光度值。

改良的快速簡(jiǎn)易法，可獲得與Folin—酚試劑法（即Lowry基本法）相接近的結(jié)果。

五、考馬斯亮蘭法（Bradford法）

（一）實(shí)驗(yàn)原理

雙縮脲法（Biuret法）和Folin—酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限制，促使科學(xué)家們?nèi)�尋找更好的蛋白質(zhì)溶液測(cè)定的方法。

1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法。

考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。

在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。

（二）Bradford法的優(yōu)缺點(diǎn)

1、Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：

（1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1g。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)－染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。

（2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。

（3）干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。

2、Bradford法的缺點(diǎn)是：

（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用r-球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。

（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣）。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。

（三）試劑與器材

1. 試劑：

（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。

（2）考馬斯亮蘭G—250染料試劑：稱(chēng)100mg考馬斯亮蘭G—250，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升。

2. 器材：

（1）可見(jiàn)光分光光度計(jì)

（2）旋渦混合器

（3）試管16支

（四）操作方法

1、標(biāo)準(zhǔn)方法

（1）取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無(wú)離子水補(bǔ)充到0.1ml。最后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭G—250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）。未知樣品的加樣量見(jiàn)下表中的第8、9、10管。

（2）加完試劑2-5分鐘后，即可開(kāi)始用比色皿，在分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595，空白對(duì)照為第1號(hào)試管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250試劑。

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長(zhǎng)時(shí)間浸泡。

 

 

考馬斯亮蘭法實(shí)驗(yàn)表格：

管號(hào)1   2     3     4     5     6     7     8     9  10

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)0  0.01  0.02   0.04  0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml) 未知蛋白質(zhì)0.02  0.04  0.06    (約1.0mg/ml) 蒸餾水0.10.09  0.08  0.06  0.04  0.02  0   0.08  0.06  0.04   考馬斯亮藍(lán) G－250試劑5.0 5.0  5.0   5.0  5.0   5.0   5.0  5.0   5.0   5.0

每管中的蛋 白質(zhì)量（g） 光吸收值 （A595）

（3）用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（g）為橫座標(biāo)，用吸光度值A(chǔ)595為縱座標(biāo)，作圖，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)出的未知樣品的A595值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.50。

2、微量法

當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時(shí)（10－100mg/ml）,可將取樣量（包括補(bǔ)加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白對(duì)照則分別為0.5ml或1.0ml H2O, 考馬斯亮藍(lán)G－250試劑仍加5.0ml, 同時(shí)作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定595nm的光吸收值。

0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.29。

六、紫外吸收法

蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

紫外吸收法簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（NH4）2SO4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測(cè)定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè)，因?yàn)榇藭r(shí)只需測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對(duì)值。

此法的特點(diǎn)是測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過(guò)查校正表，再進(jìn)行計(jì)算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ�。但是因�(yàn)椴煌�的蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過(guò)校正，測(cè)定的結(jié)果還是存在一定的誤差。

此外，進(jìn)行紫外吸收法測(cè)定時(shí)，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測(cè)定樣品時(shí)的pH要與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。

下面介紹四種紫外吸收法：

1. 280nm的光吸收法

因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測(cè)定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。

測(cè)定時(shí)，將待測(cè)蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑（水或緩沖液）作空白對(duì)照，在紫外分光度計(jì)上直接讀取280nm的吸光度值A(chǔ)280。蛋白質(zhì)濃度可控制在0.1-1.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿，盛有濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液時(shí)，A280約為1.0左右。由此可立即計(jì)算出蛋白質(zhì)的大致濃度。

許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長(zhǎng)下的光吸收值（A1％1cm）有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可查，根據(jù)此光吸收值可以較準(zhǔn)確地計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與（A1％1cm）值（即蛋白質(zhì)溶液濃度為1%，光徑為1cm時(shí)的光吸收值）的關(guān)系。文獻(xiàn)值A(chǔ)1％1cm,λ稱(chēng)為百分吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。

蛋白質(zhì)濃度=(A280´10 )/A1％1cm,280nm(mg/ml)

(1%濃度»10mg/ml)

例：牛血清清蛋白：A1％1cm=6.3 (280nm)

溶菌酶：A1％1cm=22.8 (280nm)

若查不到待測(cè)蛋白質(zhì)的A1％1cm值，則可選用一種與待測(cè)蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制的濃度為1.0mg/ml。常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為牛血清清蛋白（BSA）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取6支試管，按下表編號(hào)并加入試劑：

管號(hào)1      2      3      4      5      6

BSA（1.0mg/ml）0     1.0     2.0    3.0     4.0    5.0

H2O5.0    4.0     3.0    2.0     1.0    0

A280

用第1管為空白對(duì)照，各管溶液混勻后在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定吸光度A280，以A280為縱座標(biāo)，各管的蛋白質(zhì)濃度或蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo)作圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)為直線，利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)出的未知樣品的A280值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量，也可以用2至6管A280值與相應(yīng)的試管中的蛋白質(zhì)濃度計(jì)算出該蛋白質(zhì)的A1％1cm,280nm。

2、280nm和260nm的吸收差法

核酸對(duì)紫外光有很強(qiáng)的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng)10倍（每克），但核酸在260nm處的吸收更強(qiáng)，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數(shù)是280nm處的2倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：

純蛋白質(zhì)的光吸收比值：A280/A260»=1.8

純核酸的光吸收比值：A280/A260»=0.5

含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測(cè)定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的經(jīng)度計(jì)算出該蛋白質(zhì)的A1％1cm,280nm驗(yàn)公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。

蛋白質(zhì)濃度=1.45×A280－0.74×A260  (mg/ml)

此經(jīng)驗(yàn)公式是通過(guò)一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測(cè)定的數(shù)據(jù)來(lái)建立的。

3.  215nm與225nm的吸收差法

蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收測(cè)定時(shí)，可用215nm與225nm吸收值之差，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。

用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，配制成20～100ug/ml的一系列5.0ml的蛋白質(zhì)溶液，分別測(cè)定215nm和225nm的吸光度值，并計(jì)算出吸收差：吸收差= A215－A225。

以吸收差為縱座標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。再測(cè)出未知樣品的吸收差，即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。

本方法在蛋白質(zhì)濃度20~100mg/ml范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等緩沖液，都無(wú)顯著干擾作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、鄰苯二甲酸、巴比妥等緩沖液的215nm光吸收值較大，必須將其濃度降到0.005M以下才無(wú)顯著影響。

4. 肽鍵測(cè)定法

蛋白質(zhì)溶液在238nm處的光吸收的強(qiáng)弱，與肽鍵的多少成正比。因此可以用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制一系列50-500ug/ml已知濃度的5.0ml蛋白質(zhì)溶液，測(cè)定238nm的光吸收值A(chǔ)238，以A238為縱座標(biāo), 蛋白質(zhì)含量為橫座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品的濃度即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。

進(jìn)行蛋白質(zhì)溶液的柱層析分離時(shí)，洗脫液也可以用238nm檢測(cè)蛋白質(zhì)的峰位。

本方法比280nm吸收法靈敏。但多種有機(jī)物，如醇、酮、醛、醚、有機(jī)酸、酰胺類(lèi)和過(guò)氧化物等都有干擾作用。所以最好用無(wú)機(jī)鹽，無(wú)機(jī)堿和水溶液進(jìn)行測(cè)定。若含有有機(jī)溶劑，可先將樣品蒸干，或用其他方法除去干擾物質(zhì)，然后用水、稀酸和稀堿溶解后再作測(cè)定。

 

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