實驗原理

DNA 雙鏈分子在全長不斷增加溫度或用化學變性劑條件處理下，兩條鏈就會開始分開（即解鏈）。首先解鏈的區(qū)域由解鏈溫度較低的堿基組成。GC堿基對比AT堿基對結合得要牢固，因此GC含量高的區(qū)域具有較高的解鏈溫度。同時影響解鏈溫度的因素還有相鄰堿基間的吸引力。解鏈溫度低的區(qū)域，通常位于端部稱作低溫解鏈區(qū)。如果端部分開，那么雙螺旋就由未解鏈部分束在一起，這一區(qū)域便稱作高溫解鏈 (圖1) 。

 

圖1

如果溫度或變性劑濃度繼續(xù)升高，兩條鏈就會完全分開。變性梯度凝膠電泳法依據(jù)首要的一點是：DNA雙鏈末端一旦解鏈，其在凝膠中的電泳速度將會極劇下降。第二個根據(jù)是，如果某一區(qū)域首先解鏈，而與其僅有一個堿基之差的另一條鏈就會有不同的解鏈溫度，其電泳速度也會有明顯差別。因此，將樣品加入含有變性劑梯度的凝膠進行電泳就可將二者分開（圖 2, 1 和 2 道）。

 

圖2

最終，如果一雙鏈在其低溫解鏈區(qū)堿基錯配（異源雙鏈），而與另一等同的雙鏈相比差別僅在于此，那么，含有錯配堿基的雙鏈將在低得多的變性劑濃度下解鏈。事實上，樣品通常含有突變、正常的同源雙鏈以及配對的異源雙鏈，后者是在PCR擴增加時產(chǎn)行的。而含有錯配的雙鏈（圖2中的3和4道）通�？梢赃h遠地與兩個同源雙鏈（圖2中1和2道）分開，這種分離效果使該方法靈敏度很高。為使僅有一個堿基之差的不同分子取得最好的分離效果，必須先選擇所要研究的DNA范圍以及電泳樣品時變性劑濃度梯度。這可以按圖 2 所示的正交變性梯度實驗進行經(jīng)驗性地解決。變性劑梯度應選在曲線斜率大的部分，因為這時多數(shù)分子處于部分變性狀態(tài)這使得落入低溫解鏈區(qū)的不同分子達到最佳分離。

現(xiàn)在多數(shù)分析實驗是加入了“GC夾板”（clamp）。它是將一段長度為30-50堿基，富含GC的DNA 附加到雙鏈的一端以形成一個人為高溫解鏈區(qū)。這樣，片段的其他部分就處在低溫解鏈區(qū)從而可以對其進分析。

實驗材料

1、實驗儀器：電泳控溫槽一臺、電泳支架、程控電泳儀、梯度混合儀一套、緩沖液虹吸泵、凝膠成像儀；

2、實驗試劑：

（1）40%的凝膠單體（丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺：37.5/1）：稱取38.93g丙烯酰胺和1.07g甲叉雙丙烯酰胺，加入去離子水定容至100ml后用0.45μm的濾膜過濾后裝入棕色瓶4°C保存。

（2）100%變性劑：取42ml去離子甲酰胺、42g尿素，用去離子水定容至100 ml后用0.45μm的濾膜過濾后裝入棕色瓶4°C保存。

（3）50×TAE緩沖液（Tris 2mol/L， 冰醋酸 1mol/L，EDTA 50mmol/L，pH8.0） ；

（4）10%過硫酸銨溶液（W/V，為保證良好的引發(fā)效果，建議現(xiàn)配現(xiàn)用） ；

（5）TEMED（分析純）。

（6）梯度變性膠的配方（濃度為8%的變性膠）

 

組分	變性劑濃度60%	變性劑濃度50%	變性劑濃度25%	變性劑濃度0%
凝膠單體	2.8ml	2.8ml	2.8ml	0.8ml
100%變性劑	8.4ml	7ml	3.5ml	0
50X TAE	0.28ml	0.28ml	0.28	0.08ml
雙蒸水	2.52ml	3.92ml	7.42ml	3.12ml
10%過硫酸銨	60ul	60ul	60ul	25ul
TEMED	8ul	60ul	60ul	5ul
總體積	14ml	14ml	14ml	14ml

（7）梯度變性膠的配方（濃度為6%的變性膠）

組分	變性劑濃度60%	變性劑濃度50%	變性劑濃度25%	變性劑濃度0%
凝膠單體	2.1ml	2.1ml	2.1ml	0.6ml
100%變性劑	8.4ml	7ml	3.5ml	0
50X TAE	0.28ml	0.28ml	0.28	0.08ml
雙蒸水	3.22ml	4.62ml	8.12ml	3.32ml
10%過硫酸銨	60ul	60ul	60ul	25ul
TEMED	8ul	60ul	60ul	5ul
總體積	14ml	14ml	14ml	14ml

 

實驗過程

1、將兩塊玻璃對齊放入電泳支架上（帶缺口的玻璃缺口朝上并位于內(nèi)側），旋緊固定螺絲并夾好夾子。注入去離子水，檢測是否漏水后倒出去離子水。

2、配制高變性劑濃度凝膠溶液和低變性劑濃度凝膠溶液，在灌膠前加入適量的10%過硫酸銨溶液和TEMED作為聚合引發(fā)劑和催化劑并充分混勻。關閉梯度混合儀的兩個閥門，將高濃度變性劑凝膠溶液加入梯度混合儀靠近出口的一端，將低濃度變性劑凝膠溶液加入另一端，并打開磁力攪拌器。

3、先打開梯度混合儀出口端閥門，待液流穩(wěn)定無氣泡時將針頭插入兩塊玻璃縫隙中部，接著打開梯度混合儀中間閥門開始灌膠。

4、待凝膠灌至距上端1.5cm處時停止灌膠，加入1mL去離子水液封膠面，待凝膠聚合后，配制不含變性劑的0%凝膠，用移液器灌膠，插好梳子，待凝膠完全聚合。

5、拔出梳子，將電泳支架放入恒溫電泳槽，將各個PCR產(chǎn)物與Loading buffer混勻，然后用微量上樣器吸取樣品并加到各個上樣孔中（每個孔的DNA含量為500-800ng，PCR產(chǎn)物在瓊脂糖電泳時與Marker比較計算其大概含量，使得梯度變性膠每個孔樣品中的DNA含量盡量一致）。 一切就緒后，準備開始電泳，電壓設定為第一階段60V，時間1h 第二階段100V，時間16h，電泳儀全自動定時分段編程。

6、電泳結束后，拿出電泳架取出玻璃，將一側玻璃揭去，用EB或SYBR Green染色30min后取出凝膠，置于凝膠成像儀中拍照。

注意事項

1、實驗中提取DNA，以及DGGE操作中接觸到得較多易揮發(fā)有機試劑和有毒試劑，操作過程中須注意做好防護。

2、膠濃度根據(jù)PCR產(chǎn)物片段長度選定，一般150-400bp的選用8％的膠，400bp以上的選用6％的膠。

3、變性劑濃度范圍根據(jù)文獻報道并針對具體樣品做適當調(diào)整，使最終條帶位于變性膠中部。

4、引發(fā)劑和催化劑的具體用量可以根據(jù)氣溫以及實驗人對聚合速度的要求等具體實驗情況進行調(diào)整，文檔表格中列出的是參考用量。

5、配膠用的玻璃板須洗刷干凈，避免雜質(zhì)引起氣泡等影響凝膠的一體性，加入凝膠液之前須注意檢查玻璃板是否漏水。

6、拔取梳子的時候要注意切勿破壞上樣孔，可先將凝膠放入電泳緩沖液中浸泡，然后拔取。

7、電泳槽中提前裝入1×TAE緩沖液21L，溫度設置為60°C，插上電極和緩沖液循環(huán)管，預熱電泳緩沖液。

 

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