MOI （multiplicity of infection），即感染復(fù)數(shù)，指的是感染時病毒與細胞數(shù)量的比值。一般認為MOI是一個比值，沒有單位，其實其隱含的單位是pfu number/cell。但對于某些病毒如AAV病毒，無法用pfu表示病毒的數(shù)量，而是采用TU、IU、病毒顆粒（viral particles, v.p）或基因組數(shù)量（vector genome,v.g.）來表示病毒數(shù)量。

慢病毒（Lentivirus）載體是基于HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）的單鏈RNA病毒載體，可感染分裂或非分裂細胞，并將外源基因有效地整合到宿主染色體上，且具有較低的免疫原性，被廣泛應(yīng)用于各種體外細胞實驗中。

 

• 常見細胞MOI參考值（慢病毒）

 

• 慢病毒MOI值摸索步驟

• 實驗前信息準(zhǔn)備

目標(biāo)細胞系培養(yǎng)條件及增殖速度

排除細胞支原體污染

查閱文獻，獲得目標(biāo)細胞參考MOI值（如沒有相關(guān)文獻，則可首先設(shè)置較大梯度的MOI進行預(yù)實驗）

• MOI梯度設(shè)置

在查閱到的參考MOI值前后各設(shè)置2個梯度，每個梯度至少相差2倍，舉例：查閱到某細胞系在文獻中慢病毒MOI應(yīng)用為10，則設(shè)置MOI梯度為2.5-5-10-20-40。

 

低于參考值	低于參考值	查閱到的MOI	高于參考值	高于參考值 （可視情況省略此設(shè)置）
2.5	5	10	20	40

根據(jù)公式計算所需添加的病毒量：

MOI值=病毒滴度（TU/mL）×病毒體積（mL）/細胞個數(shù)

• 鋪細胞

在96孔板中鋪1×10⁴個細胞/孔，培養(yǎng)基定容至100μL/孔；

• 慢病毒感染

       依據(jù)所計算出的病毒體積，逐個孔添加慢病毒，并于感染次日更換新鮮培養(yǎng)基。

（5）確定MOI范圍

a．帶熒光標(biāo)簽的慢病毒：觀察熒光

感染后72小時后，于熒光顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)和熒光情況，確定細胞狀態(tài)較好且熒光數(shù)較多的孔，對應(yīng)為較適宜的MOI值。

• 不帶熒光標(biāo)簽的慢病毒：抗性篩選（puromycin/blasticidin等）

查閱相應(yīng)抗性素在相應(yīng)細胞株中的篩選濃度，于感染后72小時加入藥物，培養(yǎng)3-5天，鏡下觀察，選取細胞存活率較高且細胞狀態(tài)較好的孔，對應(yīng)為較適宜的MOI值。

（6）縮小MOI范圍進行二次摸索（附加步驟）

如需較為精確的MOI值，可在步驟（5）中確定的MOI范圍內(nèi)再設(shè)置MOI梯度，實驗方法同步驟（3）—（5）。舉例：

第一次實驗確定的最佳MOI范圍
5		10
第二次實驗的MOI設(shè)置
6	7	8	9

 

• 慢病毒感染中的常見問題

（1）怎樣提高慢病毒的感染效率？

細胞良好的生長狀態(tài)是達到高感染效率的保證。必要時可在感染時加入助感染試劑ADV-HR來提高慢病毒的感染效率。

 

（2）助感染試劑ADV-HR的使用濃度和使用方法是什么？

助感染試劑ADV-HR能夠顯著提高慢病毒的感染效率，并呈現(xiàn)劑量和時間依賴效應(yīng)。但較高濃度的ADV-HR具有細胞毒性，影響細胞狀態(tài)和感染效率。我們建議您務(wù)必于目的細胞中進行ADV-HR濃度梯度預(yù)實驗。我們在HEK293中的實驗表明，當(dāng)ADV-HR使用濃度小于等于1.0×10^-2mg/mL時，細胞狀態(tài)良好。

 

（3）慢病毒感染后為什么細胞中出現(xiàn)大量黑點，并影響細胞生長？

    在排除細菌及真菌污染后，細胞中的黑點通常為細胞碎片，導(dǎo)致細胞破碎的原因有很多，但在慢病毒感染后，細胞破碎通常有兩個原因：a. 慢病毒使用量過多，或細胞數(shù)量過少；b. 支原體污染。

    由于輕度的支原體污染并不影響細胞的生長和增殖，故支原體污染被許多實驗室所忽略。但支原體易在病毒感染細胞后爆發(fā)，故會出現(xiàn)大量細胞碎片。我們建議在使用病毒制品時，應(yīng)首先排除細胞、培養(yǎng)物及培養(yǎng)環(huán)境中的支原體污染，以節(jié)約您的寶貴時間。

（4）慢病毒應(yīng)如何保存？

    建議您于收貨后第一時間分裝，并將病毒儲存于液氮或-80℃。切勿反復(fù)凍融！在未經(jīng)凍融情況下，持續(xù)-80℃儲存環(huán)境可質(zhì)保6個月，超出該儲存條件則需重新進行質(zhì)控鑒定。