高速M(fèi)aldi成像——優(yōu)化藥物研究中的樣品分析時(shí)間
Rohan Thakur，Bruker Daltonics執(zhí)行副總裁
在過(guò)去的幾十年中，MALDI-TOF質(zhì)譜（基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間）已在大量應(yīng)用中證明了它的有效性和穩(wěn)健性，并幫助生命科學(xué)家應(yīng)對(duì)了最嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。諸多公司和學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)依靠諸如MALDI-TOF和MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜系統(tǒng)等儀器來(lái)加速其研究。病理學(xué)、生物標(biāo)志物研究、藥物表征等領(lǐng)域的科學(xué)家，試圖對(duì)腫瘤異質(zhì)性進(jìn)行描繪，并將這些信息與疾病結(jié)果聯(lián)系起來(lái)�；诘鞍踪|(zhì)分布的組織成像仍然是應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)的最強(qiáng)大的分析技術(shù)之一。
本文將重點(diǎn)討論新的激光技術(shù)是如何提高MALDI成像的樣本通量的。它將揭示MALDI技術(shù)作為一種成熟的技術(shù)是如何在藥物開(kāi)發(fā)中應(yīng)用于化合物分布分析，以及作為一種新興工具如何提高藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程的效率，特別是應(yīng)用于超高通量藥物篩選中。
當(dāng)前的挑戰(zhàn)
MALDI成像是一種空間分辨、無(wú)標(biāo)記分析技術(shù)，可直接對(duì)生物樣品進(jìn)行分析。而采集速度和樣品通量是質(zhì)譜成像（MSI）實(shí)驗(yàn)中的限制性因素，特別是在臨床研究中。因?yàn)榕R床研究需要分析大量患者的樣本，以消除個(gè)體差異。利用質(zhì)譜成像進(jìn)行臨床導(dǎo)向的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究嚴(yán)重依賴于分析速度以及穩(wěn)健的操作。當(dāng)前儀器存在的局限性限制了它的充分應(yīng)用。必須突破這種局限性，才能使科學(xué)家能夠更好地從事高通量的臨床研究。
采集速度也是高空間分辨率的MSI實(shí)驗(yàn)的制約因素，特別是對(duì)于較大組織切片的分析。新的MALDI成像解決方案標(biāo)志著在生產(chǎn)力、經(jīng)營(yíng)成本和易用性方面的范式轉(zhuǎn)變，使質(zhì)譜成像成為個(gè)性化醫(yī)學(xué)研究的強(qiáng)大而可靠的信息源。
創(chuàng)新的MALDI分析技術(shù)
MALDI在制藥環(huán)境中具有廣泛的適用性。如今，這種離子化技術(shù)被用于超高通量篩選、吸收、分布、代謝和排泄（ADME）應(yīng)用中的先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)，以及生物制藥的質(zhì)量控制，或被用于臨床微生物鑒定等生物/臨床診斷。以上這些應(yīng)用都對(duì)包括速度、結(jié)果分析時(shí)間、通量、易用性、明確性和穩(wěn)健性等有很高的要求。
儀器市場(chǎng)正在積極響應(yīng)并解決科學(xué)家關(guān)于提高樣品通量并提高數(shù)據(jù)質(zhì)量的需求，以幫助他們?cè)谧疃痰臅r(shí)間內(nèi)做出最好的決定。新的質(zhì)譜成像解決方案重新定義了MALDI成像的關(guān)鍵性能指標(biāo)，成像速度比傳統(tǒng)MALDI-TOF系統(tǒng)提升了10倍，且同時(shí)不會(huì)損失靈敏度。
化合物分布分析
雖然MALDI成像分析應(yīng)用涵蓋范圍很廣，但其共同點(diǎn)都是評(píng)估 分子在不同組織類型中的空間分布。MALDI成像是一種可直接從組織切片中檢測(cè)潛在的生物標(biāo)志物的分析技術(shù)，它在過(guò)去的十年中得到了普及。針對(duì)酶解產(chǎn)物空間分辨的實(shí)驗(yàn)流程的優(yōu)化成為研究熱點(diǎn)。最重要的是，對(duì)臨床病理學(xué)中最常見(jiàn)的樣品類型 — 福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）的病理組織，可通過(guò)原位酶切實(shí)現(xiàn)對(duì)FFPE組織中的肽的分析。此外，它還能使用肽作為替代物來(lái)對(duì)較大的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，并借助MS/MS來(lái)促進(jìn)生物標(biāo)志物的鑒定。
傳統(tǒng)儀器的采集速度僅為2像素/秒，漫長(zhǎng)的儀器運(yùn)行時(shí)間成為制約成像實(shí)驗(yàn)的瓶頸和挑戰(zhàn)。如果常規(guī)研究中樣品數(shù)目不止一個(gè)，就將很快會(huì)達(dá)到儀器運(yùn)行的極限。此外，空間分辨率的提高意味著單位面積像素?cái)?shù)目的增加以及像素直徑倒數(shù)平方值的增大。所以，無(wú)論是將科學(xué)成果進(jìn)行常規(guī)化應(yīng)用，還是應(yīng)對(duì)在更高空間分辨率下減少激光光斑大小的需求，更高的采集速度都是必須的。
此外， MALDI成像具有的更高的分子特異性也是非常有益的。現(xiàn)在正在探尋利用高分辨和MS/MS采樣模式來(lái)實(shí)現(xiàn)高的分子特異性，這要求儀器具有更快的數(shù)據(jù)采集速度，尤其是在MS/MS模式下依然保持這樣的數(shù)據(jù)采集速度。
圖1顯示了MALDI MS/MS模式下成像采集的一個(gè)實(shí)例，它顯示了在利用胰蛋白酶原位酶解組織切片后的的肽段ARTKQTAR在組織上的分布。值得注意的是，在空間分辨率為30μm的情況下，采集全部32000個(gè)像素僅花費(fèi)33分鐘。采集時(shí)間只有原來(lái)的5-10之一，使整個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)茉谝粋�(gè)工作日內(nèi)完成。它提供了一個(gè)可用來(lái)評(píng)估并優(yōu)化原位組織酶解方案的強(qiáng)大工具。
圖1：H33_小鼠的肽ARTKQTAR的MS/MS質(zhì)譜成像圖（母離子m/z: 931.54 Da -> [b+18] 碎片 m/z 775.4 Da）
質(zhì)譜成像解決方案 - 數(shù)據(jù)示例
以下實(shí)例來(lái)自新一代MALDI-TOF樣機(jī)的初始數(shù)據(jù)，它能在10μm及以下像素尺寸下達(dá)到每秒50像素（圖譜）的采集速度。所示數(shù)據(jù)來(lái)自最常見(jiàn)的MSI應(yīng)用領(lǐng)域，包括脂質(zhì)、肽和完整蛋白質(zhì)分析。
方法
樣品制備和基質(zhì)應(yīng)用是參照以前公布的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行的。在脂質(zhì)和完整蛋白質(zhì)分析中，將10μm厚的新鮮冷凍組織切片安放在導(dǎo)電載玻片上，并用自制升華裝置將DHB基質(zhì)沉積在組織表面。對(duì)于蛋白質(zhì)，當(dāng)基質(zhì)沉積后，在恒濕試驗(yàn)箱中用乙酸（5%）進(jìn)行額外的再水化步驟。而在肽分析中，則將FFPE組織薄切片（4μm）安裝在載玻片上。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作流程，對(duì)樣品進(jìn)行石蠟去除和抗原修復(fù)（Tris緩沖液，pH 為9）之后，使用ImagePrepTM 裝置（Bruker Daltonik GmbH，德國(guó)不來(lái)梅市）對(duì)樣品進(jìn)行酶解并涂覆HCCA基質(zhì)。所有MS成像數(shù)據(jù)都是在Bruker的新一代MALDI-TOF儀器（rapifleX MALDI TissuetyperTM）的樣機(jī)上采集的。該儀器是配備新型10kHz smartbeamTM 3D激光器，具有線性/反射模式，而該激光器使用經(jīng)過(guò)優(yōu)化的激光束聚焦透鏡產(chǎn)生窄聚焦（<5μm直徑）高斯分布的激光斑點(diǎn)。結(jié)合一組旋轉(zhuǎn)鏡片，激光斑點(diǎn)可以快速精確地定位在樣品上，從而實(shí)現(xiàn)真正的方形像素。
結(jié)果
基于MALDI-TOF的組織成像的三個(gè)主要應(yīng)用領(lǐng)域的初始數(shù)據(jù)如圖所示，其主要差異在于樣品制備和所分析的m/z范圍。
·脂質(zhì)分析（約500-1,500 m/z）通常以小像素進(jìn)行，以達(dá)到最高的空間分辨率（圖2）。
·完整蛋白質(zhì)分析（約2,000-20,000 m/z）。由于MALDI離子的低電荷狀態(tài)和其它類型分析器的質(zhì)量截留效應(yīng)，通常采用MALDI/TOF儀器，如rapifleX MALDI Tissuetyper（圖3）。
·（胰蛋白酶解）多肽分析（約500-4,500 m/z）是獲取FFPE組織信息的主要途徑。通常酶解步驟限制了空間分辨率（圖4）。
該平臺(tái)的性能基于以下標(biāo)準(zhǔn)：
·以高采集速度和高空間分辨率生成一致的、帶空間信息的圖像。
·在激光照射后仍能保留組織完整性，以便隨后的常規(guī)組織學(xué)檢測(cè)。
·在數(shù)據(jù)采集中和采集后，在合理的時(shí)間內(nèi)，具有對(duì)大型MSI數(shù)據(jù)集處理、分析并可視化的分析能力。
圖2：在不同的像素大�。�a-c，按比例顯示）對(duì)大鼠睪丸進(jìn)行的分析。在25μm（a）時(shí)，組織結(jié)構(gòu)不能清晰地顯示，表明需要更高的分辨率。在10μm時(shí)，可見(jiàn)清晰形態(tài)（b）。即使在最小的像素尺寸（5μm，c-e）下，組織完整性仍被完全保留。10μm像素大小下，獲取一個(gè)大型檢測(cè)結(jié)果（0.4 cm2, 394,629像素）僅耗時(shí)137分鐘（48像素/秒），顯示了高度穩(wěn)定的數(shù)據(jù)質(zhì)量（f）。五只小鼠腦切片（總像素594,434）測(cè)量用時(shí)約4小時(shí)（43像素/秒），導(dǎo)入常規(guī)臺(tái)式PC利用SCiLS Lab 2015b分析和可視化用時(shí)約2小時(shí)。這里展示的是分割圖（g）以及所有圖譜的主成分分析結(jié)果，顯示皮質(zhì)、海馬體和小腦組織的分離（h）。
圖3：矢狀大鼠腦切片（1.36 cm2），以30μm像素大�。�151,164像素）進(jìn)行分析（a）。總采集時(shí)間約4h（約11像素/秒）。其中四處離子的分布具有高度區(qū)域性，可以清楚地顯示出微妙的結(jié)構(gòu)，如海馬錐體細(xì)胞層（b）和室管膜（c）。樣品由Julian Langer（馬克斯·普朗克生物物理研究所，法蘭克福）提供。rapifleX MALDI Tissuetyper能在一個(gè)可行的時(shí)間范圍內(nèi)對(duì)較大的擴(kuò)散性腫瘤樣本進(jìn)行分析。以30μm像素大小進(jìn)行的（248,825像素）人類前列腺癌（2.24 cm2）分析（d-g）�？偛杉瘯r(shí)間約8h（約8.5像素/秒）。離子分布顯示了纖維肌組織（藍(lán)）、腫瘤細(xì)胞（綠）、鰓內(nèi)粘液材料（紅）和邊緣區(qū)域（黃）。樣品由Axel Walch（亥姆霍茲慕尼黑中心）提供。
圖4：以30μm像素大�。�180,002像素）分析感染棘球絳蟲(chóng)的人類肝臟組織（1.62 cm2）（a）�？偛杉瘯r(shí)間約2h（約24像素/秒）。包蟲(chóng)囊腫明顯與宿主組織（灰）分離。在較高放大倍數(shù)中的圖像中（b,c），囊腫的宿主（紅）和寄生蟲(chóng)層（藍(lán)）清晰可見(jiàn)。人肺癌TMA（d）。以50μm像素大�。�51,932像素）分析了99個(gè)單獨(dú)的核。5個(gè)多肽m/z值的分布如圖所示。TMA代表了對(duì)來(lái)自大量患者的樣品進(jìn)行高通量分析的一種獨(dú)特可能性。在這里，我們產(chǎn)生的數(shù)據(jù)約為1病人/分鐘。樣品由Jörg Kriegsmann（Proteopath GmbH，特里爾）提供。
腫瘤異質(zhì)性分析是腫瘤學(xué)和個(gè)性化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最重要的生物醫(yī)學(xué)研究挑戰(zhàn)之一。MALDI成像極其適合于獲取腫瘤異質(zhì)性的無(wú)偏分子視圖。MALDI儀器可提供更高的速度和性能，使科學(xué)家有可能以足夠高的空間分辨率對(duì)大型腫瘤標(biāo)本進(jìn)行分析，以獲得對(duì)腫瘤異質(zhì)性的全面理解。
提高藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程的效率
MALDI儀器運(yùn)用的新激光技術(shù)不僅提高了MALDI成像的速度，還能應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程的最初階段。藥物發(fā)現(xiàn)的過(guò)程包括在某種疾病的背景下，就相關(guān)的各種酶對(duì)幾百萬(wàn)純化合物進(jìn)行測(cè)試。這種篩選十分耗時(shí)，因此，尋找進(jìn)一步藥物開(kāi)發(fā)的先導(dǎo)化合物的代價(jià)十分高昂。
質(zhì)譜儀器已經(jīng)用于超高通量藥物發(fā)現(xiàn)篩選。與原先的MALDI-TOF儀器相比，融合了最新技術(shù)改進(jìn)的新型MALDI-TOF質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)了更高的采集速度和穩(wěn)健性。這將2,000,000次篩選活動(dòng)的耗時(shí)縮短到大約1周（取決于，例如每個(gè)樣品激光照射次數(shù)或每塊靶板可容納的樣品數(shù)量（384 vs 1536 vs 6144））。在一個(gè)實(shí)例中，在使用6144靶板進(jìn)行這樣的二百萬(wàn)次篩選活動(dòng)之后，無(wú)需清洗透鏡組1，從而實(shí)現(xiàn)最高水平的通量連續(xù)性。
達(dá)到成像性能的新高度
質(zhì)譜成像解決方案，如rapifleX MALDI-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)，可提供高采集速度（高達(dá)每秒50個(gè)真實(shí)像素以實(shí)現(xiàn)更快更好地成像）；≤10 μm的像素大小因而實(shí)現(xiàn)最高空間分辨率以獲取生物信息；無(wú)重疊以及準(zhǔn)正方形像素，從而在高通量和高空間分辨率下提供穩(wěn)定的圖像質(zhì)量。3D激光器確保了像素到像素的再現(xiàn)性，同時(shí)作為一種全新設(shè)計(jì)的離子源，也提供了更高穩(wěn)健性。
目前先進(jìn)的TOF/TOF系統(tǒng)已從基礎(chǔ)開(kāi)始重新設(shè)計(jì)，以滿足當(dāng)今對(duì)深度完整和自上而下的蛋白質(zhì)表征、以及對(duì)高性能、高通量質(zhì)譜成像（MSI）的最高要求。新一代系統(tǒng)可提供更高的速度、更高的質(zhì)譜分辨率和精度，并顯著提高MS/MS質(zhì)量范圍，以實(shí)現(xiàn)新的研究和常規(guī)應(yīng)用。研究人員需要高速度和離子源的穩(wěn)健性、更寬的動(dòng)態(tài)范圍、更高的特異性和分辨率，這些都有助于生物和臨床相關(guān)性脂質(zhì)、肽和蛋白質(zhì)的詳細(xì)表征。
科學(xué)家們?cè)谕羞@樣一種系統(tǒng)，它能提供深度蛋白質(zhì)表征及對(duì)組織、細(xì)胞培養(yǎng)物或其它應(yīng)用領(lǐng)域的成像研究。而MALDI成像作為行業(yè)引領(lǐng)者，具有更好的易用性、穩(wěn)健性和穩(wěn)定性，這對(duì)于科學(xué)研究和大規(guī)模驗(yàn)證都至關(guān)重要。從藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程的最初階段、高通量篩選（HTS），以及藥物成像——從識(shí)別潛在的候選藥物到驗(yàn)證它們?cè)诮M織中的分布和毒性，MALDI都大有可為。
參考文獻(xiàn)：
1. P. Marshall, M. Leveridge, C. Haslam, G. Clarke, J. Chandler, A. Dunn, N. Hardy, M. Pemberton, S. Dikler, J. Fuchser, Ultra High Throughput Drug Discovery Screening by MALDI-TOF Mass Spectrometry – Exceeding One Million Samples per Week, Poster W-T-223 , 第二十一屆國(guó)際質(zhì)譜大會(huì)；加拿大多倫多市；2016年8月20至26日。
Ends
作者簡(jiǎn)介
布魯克道爾頓公司的執(zhí)行副總裁。Thakur博士擁有超過(guò)20年的質(zhì)譜經(jīng)驗(yàn)，包括14年的質(zhì)譜開(kāi)發(fā)經(jīng)驗(yàn)并在離子光學(xué)領(lǐng)域擁有多項(xiàng)專利。在加入布魯克之前，他曾在Thermo公司擔(dān)任過(guò)全球營(yíng)銷主管負(fù)責(zé)質(zhì)譜解決方案，還在一家醫(yī)藥研發(fā)機(jī)構(gòu)做了2年藥物研發(fā)主管。Thakur博士從堪薩斯州立大學(xué)化學(xué)系獲得博士學(xué)位，并在羅格斯大學(xué)進(jìn)行博士后研究，在那里他的工作涉及到使用高分辨率質(zhì)譜分析證明開(kāi)環(huán)苯代謝物——DNA和蛋白質(zhì)加合物的形成。
Email: Rohan.Thakur@bruker.com
關(guān)于Bruker公司
50多年來(lái)，Bruker已幫助科研人員取得可提高人類生活品質(zhì)的突破性發(fā)現(xiàn)，并開(kāi)發(fā)出諸多新的應(yīng)用。Bruker的高性能科研儀器和寶貴的分析解決方案，使科研人員得以在分子、細(xì)胞和微觀水平上開(kāi)展對(duì)生命和材料的探索。
通過(guò)與客戶的密切合作，Bruker致力于幫助實(shí)現(xiàn)創(chuàng)新、生產(chǎn)力提升以及客戶成功，領(lǐng)域涉及生命科學(xué)分子研究、制藥應(yīng)用、顯微鏡、納米級(jí)分析、工業(yè)應(yīng)用，以及細(xì)胞生物學(xué)、臨床成像、臨床研究、微生物學(xué)和分子診斷。更多信息，請(qǐng)?jiān)L問(wèn)：http://www.bruker.com。
標(biāo)簽：
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