5月15日，中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所周斌研究組在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Circulation Research上發(fā)表了題為“Genetic Targeting of Organ-Specific Blood Vessels”的最新研究成果。該項(xiàng)工作建立一套新的遺傳操作系統(tǒng)以實(shí)現(xiàn)更加精確的遺傳靶向，可用于基因敲除和過(guò)表達(dá)。

南模生物為該研究構(gòu)建了順序交叉遺傳靶向工具小鼠模型。

到目前為止，遺傳靶向工具主要依賴于Cre-LoxP同源重組系統(tǒng)以解決細(xì)胞示蹤問(wèn)題，進(jìn)行基因功能研究。該系統(tǒng)的精度在很大程度上取決于驅(qū)動(dòng)Cre的啟動(dòng)子或基因表達(dá)的特異性。也就是指，如果將Cre表達(dá)元件插入到A基因中，那么在表達(dá)A基因的細(xì)胞中可以發(fā)揮Cre重組作用。而A基因往往并不能特異性地只在某種特定器官或組織中表達(dá)，所以這種傳統(tǒng)方法具有固有的局限性。

例如：研究血管常用的遺傳工具鼠有VE-cad-Cre、Tie2-Cre等，然而這些工具鼠標(biāo)記的是所有的內(nèi)皮細(xì)胞，而無(wú)法精確地研究特定組織器官的血管。不同器官的血管在結(jié)構(gòu)及功能上是異質(zhì)性的。不同器官的內(nèi)皮細(xì)胞在損傷反應(yīng)中的作用都是獨(dú)特的。因此，如何提高遺傳靶向的精度，開(kāi)發(fā)組織特異性Cre工具鼠，對(duì)于研究特定細(xì)胞類(lèi)型在某一種器官形成及再生過(guò)程中的深入功能研究具有重要意義。

在這項(xiàng)最新的研究中，研究人員精妙地利用Cre-loxP和Dre-rox兩套系統(tǒng)，互相排他的重組系統(tǒng)進(jìn)行順序交叉遺傳靶向操縱，實(shí)現(xiàn)精確地遺傳靶向器官特異性的血管。

核 心：順序交叉遺傳靶向操縱系統(tǒng)

兩個(gè)要素：

兩種不同的啟動(dòng)子分別來(lái)驅(qū)動(dòng)Dre和Cre —— A-Dre 和 B-CrexER（下圖B）。

• A-Dre：通過(guò) knockin 方式，將 Dre 插入到 A基因座中，使 Dre 的表達(dá)與 A基因的表達(dá)譜一致。

• B-CrexER：通過(guò) knockin 方式，將 CrexER 元件插入到 B基因座中。CrexER是一種新型的誘導(dǎo)型工具鼠——將兩個(gè)rox位點(diǎn)分別放置于雌激素受體（ER）的兩側(cè)，即Cre-rox-ER-rox。

按照這個(gè)順序交叉靶向系統(tǒng)的設(shè)計(jì)（下圖C），一般情況下，Cre-ER融合蛋白停留在細(xì)胞質(zhì)中，無(wú)法入核進(jìn)行Cre-LoxP反應(yīng)。只有在同時(shí)表達(dá)A基因和B基因的細(xì)胞中，Dre重組酶將識(shí)別并切割Rox位點(diǎn)，之后B-Cre從細(xì)胞質(zhì)中釋放入核，進(jìn)行后續(xù)的Cre-LoxP重組反應(yīng)。

利用神經(jīng)嵴表達(dá)的 Nrg1-CrexER 與廣泛表達(dá)的 CAG-Dre 驗(yàn)證了  CrexER 在經(jīng) Dre 切除了 ER-rox 后，Cre-rox融合蛋白仍具有重組酶活性，且特異而有效地在體內(nèi)發(fā)揮Cre重組酶作用。并且 CrexER本身沒(méi)有漏表達(dá)情況的發(fā)生。這些數(shù)據(jù)驗(yàn)證了Dre介導(dǎo)的Cre表達(dá)的策略的可行性，并證實(shí)了這種新型CrexER可用于進(jìn)行體內(nèi)順序交叉遺傳靶向。

圖1. Proof-of-principle for a sequential recombination strategy for genetic targeting.

順序交叉遺傳靶向操縱系統(tǒng)是利用兩個(gè)啟動(dòng)子更加精確地限定了標(biāo)記的細(xì)胞，并且最后的有效輸出是Cre重組酶。而兩個(gè)標(biāo)記基因A和B的選擇對(duì)于整個(gè)系統(tǒng)是否成功至關(guān)重要，需要前期文獻(xiàn)與實(shí)驗(yàn)中對(duì)表達(dá)譜有全面的了解。

這項(xiàng)研究中，研究人員就分別在心臟和大腦中各找到了2個(gè)Marker基因，成功地實(shí)現(xiàn)了在心臟和大腦中特異性標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞。

應(yīng)用1：心臟冠狀內(nèi)皮細(xì)胞特異性CoEC-Cre

• Tie2-Dre：Tie2是泛內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，在大多數(shù)血管以及某些骨髓細(xì)胞群中均有表達(dá)。通過(guò)將Dre敲入到內(nèi)源Tie2基因的ATG位置，建立Tie2-Dre工具鼠。

• Wt1-CrexER：有報(bào)道稱間皮細(xì)胞標(biāo)志物Wt1在發(fā)育中的冠狀動(dòng)脈血管中表達(dá)，但不在其他血管中表達(dá)。除了心外膜細(xì)胞外，Wt1-CreER在胚胎心臟中標(biāo)記冠狀內(nèi)皮細(xì)胞。通過(guò)將CrexER插入到Wt1基因的翻譯起始密碼子（ATG）位置，建立Wt1-CrexER工具鼠。（圖2A-B）

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Tie2-Dre;Wt1-CrexER確實(shí)可以特異且有效地標(biāo)記冠狀血管（圖2C-E）。作為內(nèi)部對(duì)照，沒(méi)有檢測(cè)到Tie2-Dre;R26-tdTomato組織中的任何tdTomato+細(xì)胞，從而排除了Dre-loxP重組。Wt1-CrexER; T26-tdTomato小鼠中在未給他莫昔芬處理的情況下，也沒(méi)有檢測(cè)到任何tdTomato+細(xì)胞，說(shuō)明Wt1-CrexER沒(méi)有漏表達(dá)。

這些數(shù)據(jù)表明Cre-loxP重組僅在Tie2-Dre和Wt1-CrexER雙重組系統(tǒng)中才發(fā)生，Tie2-Dre;Wt1-CrexER（以下簡(jiǎn)稱 CoEC-Cre ）可排它性地特異靶向心臟血管。接下來(lái)驗(yàn)證雙重組系統(tǒng)在基因敲除或過(guò)表達(dá)中的應(yīng)用。

圖2. Genetic targeting of coronary vessels by Tie2-Dre;Wt1-CrexER line.

冠狀血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異性基因操縱

心臟特異性血管中的基因敲除

VEGFR2（Kdr）在大多數(shù)器官的內(nèi)皮細(xì)胞中普遍表達(dá)，過(guò)去要在冠狀動(dòng)脈中特異性靶向該基因幾乎是不可能做到的，因此選擇Kdr基因作為靶基因來(lái)驗(yàn)證CoER-Cre系統(tǒng)在條件性基因敲除中的應(yīng)用。

通過(guò)Kdr flox小鼠與CoEC-Cre（Tie2-Dre;Wt1-CrexER）交配（圖3A）。為了同時(shí)能夠示蹤，再引入R26-tdTomato報(bào)告基因小鼠。

• 敲除組為：Tie2-DRE;WT1-CrexER; Kdrflox/flox;R26-tdTomato小鼠；

• 同窩對(duì)照組為：Tie2-DRE;WT1-CrexER; Kdrflox/+;R26-tdTomato小鼠。

E14.5心臟切片免疫染色檢測(cè)tdTomato、VEGFR2和CDH5，結(jié)果顯示VEGFR2在tdTomato+ CDH5+冠狀內(nèi)皮細(xì)胞敲除組小鼠心臟的致密心肌內(nèi)的缺失（圖3B-D）。而在心肌小梁的心內(nèi)膜細(xì)胞中，VEGFR2表達(dá)不受影響，表明CoEC-Cre重組特異性靶向表達(dá)Wt1的冠狀內(nèi)皮細(xì)胞，而不是心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞（胚胎期不表達(dá)Wt1）。

心臟特異性血管中的基因過(guò)表達(dá)

選擇人類(lèi)白喉毒素受體（DTR）作為過(guò)表達(dá)基因。將CoEC-Cre與R26-iDTR小鼠雜交，其中DTR表達(dá)受Cre-loxP重組作用的控制（圖3E）。可以通過(guò)白喉毒素（DT）處理來(lái)特異性消除表達(dá)DTR的冠狀內(nèi)皮細(xì)胞，從而驗(yàn)證這套系統(tǒng)在基因過(guò)表達(dá)中也是可行的。免疫染色顯示僅在冠狀內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)DTR（圖3F）；內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的嚴(yán)重破壞，說(shuō)明細(xì)胞凋亡（圖3G）。Tie2-Dre; Wt1-CrexER; R26-iDTR小鼠DT給藥組和未給藥對(duì)照組的心臟切片TUNEL+細(xì)胞數(shù)目有顯著差異（圖3H，I）。

綜合上述基因敲除和過(guò)表達(dá)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，表明新的基因靶向系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)排它性地在冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中允進(jìn)行基因操作，而不影響其他器官系統(tǒng)。

圖3. Gene knockout and over-expression in coronary endothelial cells.

應(yīng)用2：大腦內(nèi)皮細(xì)胞特異性BEC-Cre

• Tie2-Dre：同上文

• Mfsd2a-CrexER：先前的研究表明Mfsd2a在腦內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，但也在其他細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)（圖4A）。將編碼CrexER的cDNA插入到Mfsd2a基因的第一個(gè)外顯子的ATG位置，建立Mfsd2a-CrexER工具小鼠，并驗(yàn)證了該小鼠中CreER的表達(dá)。然后將Tie2-Dre工具鼠與之交配，獲得Tie2-Dre;Mfsd2a-CrexER雙陽(yáng)性小鼠（以下稱為BEC-Cre）（圖4B）。

與常規(guī)靶向腦血管和神經(jīng)元的Mfsd2a-CreER相比，BEC-Cre能夠有效且特異地靶向腦血管，特異性優(yōu)于Mfsd2a-CreER，而不標(biāo)記任何神經(jīng)元（圖4C-E）。更重要的是，除了特異性，BEC-Cre相比傳統(tǒng)的Mfsd2a-CreER，能夠在腦內(nèi)皮細(xì)胞中更有效地發(fā)揮Cre重組作用（圖4E）。另外，BEC-Cre沒(méi)有靶向任何門(mén)靜脈肝細(xì)胞，也沒(méi)有靶向其他器官或組織中的血管。tdTomato+內(nèi)皮細(xì)胞在腦和其他器官或組織中的百分比定量統(tǒng)計(jì)也證實(shí)了BEC-Cre小鼠的效率和特異性（圖4G）。

圖4. Specific and efficient brain endothelial cell targeting。

腦特異性血管內(nèi)皮細(xì)胞中的基因操縱

腦特異性血管中的基因敲除

同樣地，再次使用VEGFR2（Kdr）作為靶基因，獲得基因敲除組（Tie2-Dre; Mfsd2a-CrexER; Kdrflox/flox; R26-tdTomato）和同窩對(duì)照組（Tie2-Dre; Mfsd2a-CrexER; Kdrflox/+; R26-tdTomato）小鼠（圖5A）。在新生小鼠大腦中，基因敲除組幾乎檢測(cè)不到VEGFR2+血管（圖5B-C）；而其他器官或組織中的血管中沒(méi)有檢測(cè)VEGFR2表達(dá)的降低，證明Kdr在腦血管中的特異性缺失。與對(duì)照組相比，基因敲除組中的血管密度顯著降低（圖5D）；還觀察到無(wú)血管區(qū)域的擴(kuò)大，大腦缺氧的情況明顯增加（圖5E），證實(shí)腦血管密度降低對(duì)組織氧合的影響。除了減少的血管生成外，敲除組小鼠腦血管的形態(tài)異常（圖5F）。

另外，通過(guò)注射10-kDa葡聚糖示蹤實(shí)驗(yàn)以及tdTomato、紅細(xì)胞標(biāo)志物Ter-119、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（Glut1）免疫染色，發(fā)現(xiàn)毛細(xì)血管泄漏，證實(shí)Kdr缺失對(duì)血管完整性的影響（圖6A-C）。而且，Kdr敲除組小鼠大腦內(nèi)皮細(xì)胞蛋白質(zhì)組成也發(fā)生了變化，BBB內(nèi)皮細(xì)胞中顯著誘導(dǎo)出了原本并不表達(dá)的質(zhì)膜囊泡相關(guān)蛋白（PLVAP）（圖6D）。在BEC-Cre介導(dǎo)的Kdr特異性敲除小鼠中，β-catenin（CTNNB1）的表達(dá)顯著減少（圖6E）。

綜合這些結(jié)果，利用BEC-Cre介導(dǎo)腦血管特異性敲除，規(guī)避了常規(guī)全身Kdr敲除的胚胎早期致死，并證明Kdr是中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管生成所必需的。VEGF信號(hào)通路調(diào)節(jié)了與BBB內(nèi)皮細(xì)胞完整性相關(guān)的基因。

圖5. Specific knockout of VEGFR2 in brain endothelial cells.

圖6. Vegfa-Vegfr2 signaling regulates BBB integrity.

這項(xiàng)研究成功構(gòu)建了心臟冠狀動(dòng)脈特異性Cre（CoEC-Cre）和大腦血管特異性Cre（BEC-Cre），并利用順序交叉遺傳靶向系統(tǒng)揭示了VEGF信號(hào)通路參與調(diào)控大腦血管新生及血腦屏障的形成。

隨著 knockin 技術(shù)的日益普及，Cre工具鼠的建立已經(jīng)變得越來(lái)越便捷；這也就使得特異性靶向的基因敲除與基因過(guò)表達(dá)可以變得越來(lái)越精細(xì)。

Dre與CrexER聯(lián)用的這種新的順序交叉遺傳靶向系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)在特定細(xì)胞群體中進(jìn)行精確的基因操作，為組織特異性基因操作提供了一個(gè)有效的策略，可以廣泛地應(yīng)用到其他生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。是不是很妙呢？

南模生物利用CRISPR基因編輯技術(shù)和ES細(xì)胞打靶技術(shù)，為該研究構(gòu)建了包括：Nrg1-CrexER, Nrg1-CreER, Wt1-CrexER, Tie2-Dre, Mfsd2a-CrexER 在內(nèi)的多種工具小鼠模型。

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