上個(gè)月，中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所周斌研究組又有新科研成果發(fā)表在 Scientific Reports 上啦，題為“Genetic targeting of Purkinje fibres by Sema3a-CreERT2 ”，提供了一種新的遺傳學(xué)工具——Sema3a-CreERT2工具鼠——用于研究調(diào)節(jié)浦肯野纖維功能的分子機(jī)制。

本研究中Sema3a-CreERT2 工具鼠由上海南方模式生物構(gòu)建。

研究背景：

心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)（cardiac conduction system ）是由位于心壁內(nèi)，由特有的功能高度分化的心肌細(xì)胞構(gòu)成，其功能是產(chǎn)生電沖動(dòng)并傳導(dǎo)到心臟各部，使心房肌和心室肌按一定節(jié)律性收縮。心臟收縮從右心房竇房結(jié)（SA結(jié)）開始。然后，電活動(dòng)在房室結(jié)（AV結(jié)）處延遲，隨后通過房室束（His束及束支）快速傳導(dǎo)并迅速地傳播到整個(gè)心室壁。心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)功能異常就可能導(dǎo)致心律失常。

（圖片來源：https://en.wikipedia.org/wiki/file:ECG_Principle_fast.gif）

本文的主角，浦肯野纖維（Purkinje fiber），是構(gòu)成房室束及其分支的主要細(xì)胞，又稱束細(xì)胞。浦肯野纖維細(xì)胞間連接及其離子通道機(jī)制是保證心臟電沖動(dòng)正常傳導(dǎo)的基礎(chǔ)，當(dāng)細(xì)胞間連接及跨膜離子流發(fā)生變化時(shí)，浦肯野纖維系統(tǒng)電生理發(fā)生改變，從而導(dǎo)致心律失常。因此，了解調(diào)節(jié)浦肯野纖維發(fā)育、形成、以及維持正常功能的分子機(jī)制就將為心律失常的病理生理過程提供解釋與證據(jù)。

圖2.  Isolated heart conduction system showing Purkinje fibers

先前的研究中，有一些Cre或CreERT2工具鼠被用來標(biāo)記心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)。比如：

• 用Hcn4-CreERT2來標(biāo)記傳導(dǎo)系統(tǒng)，包括竇房結(jié)、部分房室結(jié)、His束、束支和浦肯野纖維。不過，除傳導(dǎo)系統(tǒng)以外，Hcn4-CreERT2還會(huì)把發(fā)育中的心臟的部分內(nèi)皮細(xì)胞也標(biāo)記上。
• Cntn2-Cre也是心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的另一種遺傳工具，它特異性靶向SA結(jié)、AV結(jié)，左束支和右束支以及浦肯野纖維。
• Cx40-CreERT2靶向心房和VCS心肌細(xì)胞，以及冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。

可惜的是，缺乏特異性靶向浦肯野纖維（而不靶向其它細(xì)胞）的專一性工具，對(duì)于專門研究浦肯野纖維的功能還是不夠的。

小鼠模型：

Sema3a-CreERT2小鼠：

由于已知Sema3a基因敲除純合子小鼠具有感覺和交感神經(jīng)元異常、胚胎骨和軟骨結(jié)構(gòu)異常、心臟缺陷和出生后死亡的嚴(yán)重不良表型，故利用經(jīng)典 ES 細(xì)胞打靶技術(shù)，將誘導(dǎo)型 CreERT2 插入到小鼠 Sema3a 基因的起始密碼子位置，構(gòu)建Sema3a-CreERT2小鼠模型。該品系由上海南方模式生物構(gòu)建。

圖3. Sema3a-CreERT2構(gòu)建策略于基因型鑒定結(jié)果。

R26-tdTomato 小鼠：在小鼠Rosa26位點(diǎn)定點(diǎn)插入條件性表達(dá)的tdTomato報(bào)告基因。

研究結(jié)果：

構(gòu)建Sema3a-CreERT2小鼠模型。

Sema3a是從無脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物都保守的信號(hào)素家族的成員。研究表明Sema3a在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中具有重要作用。 Sema3a可能是一種化學(xué)抑制劑，可以抑制軸突的生長，尤其是外周神經(jīng)軸突，從而維持正常的神經(jīng)元形態(tài)模式。 Sema3a的過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)疾病，如精神分裂癥；而Sema3a缺陷又導(dǎo)致異常的神經(jīng)元系統(tǒng)。此外，Sema3a還在免疫調(diào)節(jié)和癌癥發(fā)展中起到生理作用。最近的一項(xiàng)研究表明Sema3a可以通過調(diào)節(jié)交感神經(jīng)支配的模式來保持正常的心律。雖然有研究發(fā)現(xiàn)Sema3a在Purkinje纖維和小梁心肌細(xì)胞亞組中表達(dá)，但Sema3a在心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)中的譜系追蹤卻至今沒有報(bào)道。
利用經(jīng)典 ES 細(xì)胞打靶技術(shù)，將誘導(dǎo)型 CreERT2 插入到小鼠 Sema3a 基因的起始密碼子位置，構(gòu)建Sema3a-CreERT2小鼠模型。用雌激素受體（ESR）抗體染色作為Sema3a的替代物，檢測Sema3a在Sema3a-CreERT2小鼠組織中的表達(dá)。 在E12.5，E14.5和E19.5胚胎心臟切片中對(duì) ESR（代替Sema3a）和TNNI3（心肌細(xì)胞Marker） 共染色。免疫染色結(jié)果顯示ESR/Sema3a主要在小梁心肌表達(dá)，但在E12.5和E14.5天的胚胎心臟致密層中也檢測到少量的表達(dá)。在E19.5天，ESR/Sema3a在位于心室腔側(cè)的心內(nèi)膜下小梁心肌細(xì)胞中表達(dá)。在致密心肌的心肌細(xì)胞或冠狀動(dòng)脈中未檢測到ESR/Sema3a。總之，這些數(shù)據(jù)與早前對(duì)Sema3a表達(dá)的研究一致，證明了Sema3a-CreERT2小鼠構(gòu)建成功。

圖4. （a-b）Sema3a-CreERT2構(gòu)建策略于基因型鑒定結(jié)果。（c）在E12.5，E14.5和E19.5天 Sema3a-CreERT2小鼠心臟雌激素受體（ESR）免疫熒光染色，指示Sema3a的表達(dá)。 箭頭指示Sema3a+心肌細(xì)胞。 

Sema3a-CreERT2在成年小鼠心臟中標(biāo)記浦肯野纖維。

根據(jù)Sema3a-CreERT2小鼠的ESR染色分析，Sema3a主要在小梁心肌細(xì)胞中表達(dá)，而不是在致密層中。由于浦肯野纖維主要集中在心室壁的最內(nèi)層，接下來就需要確定Sema3a-CreERT2是否可以特異性靶向成年小鼠心臟中的浦肯野纖維。通過Sema3a-CreERT2與R26-tdTomato小鼠交配獲得Sema3a-CreERT2; R26-tdTomato雙陽性小鼠。 只有在他莫昔芬存在時(shí)，CreERT2才會(huì)從細(xì)胞質(zhì)易位到細(xì)胞核中進(jìn)行Cre-loxP重組，這就可以使Sema3a +細(xì)胞及其后代中永久標(biāo)記上tdTomato紅色熒光（RFP）（圖5b）。

對(duì)8-12周齡的小鼠給予他莫昔芬誘導(dǎo)，并在他莫昔芬處理48小時(shí)后收集心臟組織樣本，發(fā)現(xiàn)在心房心肌細(xì)胞有稀疏的RFP+細(xì)胞（圖5c-d）。為了確定Sema3a是否在SA結(jié)和AV結(jié)中表達(dá)，對(duì)HCN4和RFP進(jìn)行共染色，發(fā)現(xiàn)Sema3a在SA結(jié)中不表達(dá)并且在AV節(jié)點(diǎn)中有少量表達(dá)（圖5e-f）。Cx40在研究中被用來作為心室傳導(dǎo)系統(tǒng)（VCS）marker，因此我們生成了Sema3a CreERT2; R26-tdTomato; Cx40 GFP三陽性小鼠來檢測浦肯野纖維中Sema3a的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)RFP與GFP+細(xì)胞共同定位于心室壁的心內(nèi)膜下層，而致密心肌中的GFP+冠狀動(dòng)脈則未檢測到RFP信號(hào)（圖5g）。心臟整體熒光結(jié)果顯示Cx40在心房中表現(xiàn)出總體表達(dá)，而幾乎未檢測到Sema3a。 Cx40也在His（HB）束中，在左束支和右束支以及浦肯野纖維中表達(dá)，這與之前的報(bào)道一致。與Cx40（GFP信號(hào)）相比，Sema3a（RFP信號(hào)）很大程度上只存在浦肯野纖維中，并且在His束或束支中也沒有檢測到（圖5h-i）。 Z-stack共聚焦證實(shí)Sema3a（RFP信號(hào)）在心室心肌心內(nèi)膜下的Cx40陽性浦肯野纖維中表達(dá)（圖5j）。這些數(shù)據(jù)表明，Sema3a-CreERT2能夠特異性靶向成年小鼠心臟中的心室浦肯野纖維。

圖5. 成年小鼠心臟中Sema3a表達(dá)譜。 （a）Sema3a-CreERT2; R26-tdTomato小鼠交配示意圖。 （b）通過他莫昔芬誘導(dǎo)標(biāo)記Sema3a+細(xì)胞示意圖。 （c）Sema3a-CreERT2; R26-tdTomato小鼠心臟整體紅色熒光RFP表達(dá)示意圖。 （d）Sema3a-CreERT2; R26-tdTomato小鼠RFP和TNNI3免疫熒光染色顯示心房中RFP+細(xì)胞稀少。 （e）在SA結(jié)中未檢測到Sema3a+細(xì)胞。 （f）Sema3a在AV結(jié)中的表達(dá)。 （g）Sema3a-CreERT2; R26-tdTomato小鼠中RFP，GFP和TNNI3的免疫染色顯示CX40+冠狀動(dòng)脈（箭頭所示）呈RFP陰性。 （h）Sema3a-CreERT2; R26-tdTomato; Cx40-GFP小鼠心臟的整體熒光視圖。虛線表示IVS和LVW之間的界限。 （i）對(duì)Sema3a-CreERT2; R26-tdTomato; Cx40-GFP小鼠心臟LBB或RBB中未檢測到Sema3a，而Cx40-GFP為陽性。 （j） Z-stack共聚焦顯示Sema3a在浦肯野纖維中表達(dá)。

利用Sema3a-CreERT2對(duì)浦肯野纖維進(jìn)行譜系追蹤。

由于Sema3a在胚胎時(shí)期比在成年后具有更廣泛地表達(dá)，那么問題來了，Sema3a+心肌細(xì)胞是什么時(shí)候開始向浦肯野纖維的命運(yùn)發(fā)展的呢？
將他莫昔芬注射到E12.5，E14.5或E18.5天的Sema3a-CreERT2; R26-tdTomato; Cx40-GFP三陽性小鼠中，并在P7或P21天對(duì)小鼠心臟進(jìn)行分析。譜系示蹤數(shù)據(jù)顯示E12.5開始誘導(dǎo)標(biāo)記的Sema3a+細(xì)胞在P7和P21時(shí)產(chǎn)生了Cx40陽性的浦肯野纖維（少數(shù)）和Cx40陰性的工作心肌細(xì)胞（大部分）（圖6a-b）。 E14.5的Sema3a+細(xì)胞更局限于心室心肌的心內(nèi)膜層，并在P7和P21時(shí)產(chǎn)生Cx40陽性的浦肯野纖維和Cx40陰性的工作心肌細(xì)胞（圖6c-d）。E18.5開始誘導(dǎo)標(biāo)記的Sema3a+細(xì)胞在P7和P21天的心室心內(nèi)膜下表面產(chǎn)生了幾乎所有的Cx40陽性的浦肯野纖維，而Cx40陰性的工作心肌細(xì)胞則很少（圖6e-f）。這些數(shù)據(jù)表明，Sema3a+心肌細(xì)胞在圍產(chǎn)期階段（例如E18.5天）開始了其心室傳導(dǎo)系統(tǒng)特化的命運(yùn)（圖6g）。

圖6.  Sema3a+心肌細(xì)胞在心臟發(fā)育過程中的傳導(dǎo)系統(tǒng)特化。

（a-f）在E12.5（a，b），E14.5（c，d）和E18.5（e，f）對(duì)Sema3a-CreERT2;R26-tdTomato; Cx40-GFP三陽性小鼠給予他莫昔芬誘導(dǎo)。 每組在P7和P21收集心臟。Z-stack共聚焦顯示Sema3a與Cx40熒光表達(dá)情況。（g）示意圖分別表示發(fā)育中和成年心臟中的Sema3a +細(xì)胞（紅色）和Cx40 +細(xì)胞（綠色）。

Sema3a+心肌細(xì)胞的定量。

Sema3a+心肌細(xì)胞在心臟中到底占多大比例呢？通過將他莫昔芬注射到成年小鼠中體內(nèi)誘導(dǎo)Sema3a+標(biāo)記，在他莫昔芬處理48小時(shí)后對(duì)心臟進(jìn)行分析。 RFP和TNNI3免疫熒光染色顯示在心室心肌的心內(nèi)膜下表面的RFP+心肌細(xì)胞（圖7a）。對(duì)心臟切片中RFP+心肌細(xì)胞比例進(jìn)行定量分析，結(jié)果1.02±0.13％心肌細(xì)胞被Sema3a-CreERT2標(biāo)記上紅色熒光，而在他莫昔芬未處理的情況下幾乎沒有心肌細(xì)胞被標(biāo)記上（圖7c）。將心肌細(xì)胞分離出來進(jìn)行定量（圖7b，d）也得到了一致的結(jié)果。

圖7. 成年心臟中Sema3a+心肌細(xì)胞數(shù)量的定量分析。 

（a）成年心臟中RFP和TNNI3的免疫熒光染色。 IVS，室間隔; RVW，右心室壁。（b）來自成年Sema3a CreERT2; R26-tdtomato小鼠的分離后心肌細(xì)胞。 （c）定量心臟RFP+心肌細(xì)胞的百分比。 （d）定量分離后的RFP+心肌細(xì)胞百分比。 

Sema3a-CreERT2 作為一種全新的遺傳工具小鼠，它特異性靶向成年小鼠心臟中的浦肯野纖維。它較Hcn4-CreERT2（靶向竇房結(jié)、房室結(jié)、His束、束支和浦肯野纖維）和Cntn2-Cre（靶向SA結(jié)，AV結(jié)和His-Purkinje系統(tǒng)）對(duì)浦肯野纖維更具有針對(duì)性。與Cx40-CreERT2工具相比，Sema3a-CreERT2也不會(huì)標(biāo)記冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞或心房心肌細(xì)胞。

對(duì)浦肯野纖維的譜系示蹤結(jié)果表明，Sema3a+細(xì)胞在早期胚胎階段主要向小梁心肌細(xì)胞發(fā)育，而在圍產(chǎn)期期間，Sema3a+心肌細(xì)胞呈現(xiàn)特化為浦肯野纖維的命運(yùn)。

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