在之前的一篇文章中，我談到了彎曲條帶，這是一個常見由于凝膠鑄造和跑膠所引起的問題。 然而，雖然轉(zhuǎn)印似乎是一個更簡單的過程，但也很容易出錯。 下面我將介紹幾個有用的建議，讓您無時無刻地檢測到您的蛋白。

沒有條帶，意味著什么？

不幸的是，第一次你可能會認(rèn)為你的轉(zhuǎn)印沒有起作用，當(dāng)你在在暗室里成像時，沒有條帶（或者在實(shí)驗(yàn)室的生物成像儀前面，但是做出結(jié)果的可能性不大）

第一步—簡單的轉(zhuǎn)印檢查

我們實(shí)驗(yàn)者多使用預(yù)染Marker，簡單的轉(zhuǎn)印效率檢查是檢查您的凝膠中是否有任何殘留的染料。 你的Marker應(yīng)該全部轉(zhuǎn)移，如果沒有，你的程序可能是錯誤的。 在這種情況下，嘗試更長時間轉(zhuǎn)印，冷凝裝置轉(zhuǎn)印和重新配置緩沖buffer。

如果你完全沒有看到，那么檢查你的轉(zhuǎn)印的極性。 查看“三明治結(jié)構(gòu)”是否有錯誤 如果可以，考慮對三明治設(shè)備進(jìn)行顏色編碼，并確保始終保持正確的極性。

第二步-詳細(xì)的轉(zhuǎn)印檢查

如果您想要更多信息，那么簡單的麗春紅染色是驗(yàn)證您的轉(zhuǎn)移的一個很好的步驟。 在轉(zhuǎn)移后立即執(zhí)行，這是檢查您的泳道長度有效轉(zhuǎn)移的好方法。 染色PVDF和硝酸纖維素膜很好，麗春紅不適合染色尼龍膜。 再次，如果看到您的泳道長度轉(zhuǎn)印不佳，并嘗試更長時間，冷凝裝置轉(zhuǎn)印或重新配置轉(zhuǎn)印buffer。

麗春紅染色的膜顯示出有效的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移。 在大分子量和小分子量下的轉(zhuǎn)移效力有所降低。

現(xiàn)在有更好的免染膠技術(shù)，免染凝膠技術(shù)在不使用分析試劑盒和熒光染料的條件下可在蛋白凝膠和s轉(zhuǎn)印膜上檢測到蛋白條帶，免染凝膠含有三鹵代化合物與蛋白中的色氨酸殘基共價交聯(lián)產(chǎn)生熒光產(chǎn)物。電泳之后，蛋白分離，使用 UV進(jìn)行交聯(lián)。UV 交聯(lián)之后，產(chǎn)生的熒光能夠被成像系統(tǒng)捕捉到，例如：Azure C 系列成像系統(tǒng)。免染技術(shù)不影響下游的檢測，結(jié)果可用于樣本的全蛋白定量（TPN），使用免染技術(shù)開展全蛋白定量，在抗體孵育之前印跡膜上的總蛋白可在成像系統(tǒng)中的 UV 模式下檢測到。每個泳道的總蛋白量通過計(jì)算泳道內(nèi)條帶的熒光強(qiáng)度來確定的。抗體檢測完成之后，每個泳道的目的蛋白被歸一化到同一泳道的總蛋白中。

第三步-查看蛋白

如果您的蛋白分子量高（>120 kDa）或低（< 25 kDa）分子量，那么您應(yīng)考慮更改轉(zhuǎn)印條件。 對于大分子量蛋白，考慮增加轉(zhuǎn)印時間，有時甚至可以過夜，但保持轉(zhuǎn)印在冷環(huán)境是很重要的。 對于較小分子量的蛋白質(zhì)，考慮減少轉(zhuǎn)印時間并降低電壓，以防止蛋白質(zhì)完全通過膜。

對于大分子量蛋白，可能值得考慮使用低濃度的凝膠來容易地將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到膜中。 相反，小蛋白質(zhì)容易離開凝膠透過膜，可以使用的孔徑0.2μm的膜。

最后，您的轉(zhuǎn)印緩沖液的組成可以對您的蛋白質(zhì)移印和結(jié)合容易程度產(chǎn)生巨大的影響。 對于大分子量蛋白，SDS可以促進(jìn)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上，而甲醇促進(jìn)蛋白和膜結(jié)合，但抑制轉(zhuǎn)印。 因此可以考慮將甲醇稍微降至5-10％，并加入SDS至濃度為0.1％。 對于面臨其他問題的非常小的蛋白，SDS應(yīng)從轉(zhuǎn)移緩沖液中消除，甲醇濃度提高到20％。

第四步-如果還沒有條帶？

在這一點(diǎn)上，熟練的人做轉(zhuǎn)印，但仍然沒有看到任何東西？ 如果您正在使用非常低豐度的蛋白或品質(zhì)不好的抗體，那么在這一點(diǎn)上，值得檢查的東西應(yīng)該被肯定地表達(dá)出來。