當western blot進行定量時，許多人認為只需將感興趣的蛋白質(zhì)成像，剝離，重孵育內(nèi)參蛋白，然后將其用于歸一化，而不考慮線性范圍的檢測。 然而，與此有關(guān)的幾個誤區(qū)，越來越多的期刊現(xiàn)在要求一個適當?shù)亩�義的標準化流程，包括線性檢測的證明，還包括所有草稿。

線性檢測是條帶強度與膜上目標蛋白成比例的區(qū)域。 隨著蛋白量增加，條帶強度應(yīng)該增加。 在下面的圖片中，您可以看到問題在哪里，線性范圍標有藍色框，在該區(qū)域之外，該比例關(guān)系丟失，特別是在信號完全過飽和或極低的表達量時。

蛋白質(zhì)印跡的定量在目標蛋白和上樣對照兩者都具有相似的線性范圍的情況下，蛋白質(zhì)印跡定量才是真正準確，因此，當上樣質(zhì)控對照被考慮時，事情變得更復雜。 這在下面的兩張圖中顯示; 在第一個檢測線性范圍重疊的地方，蛋白質(zhì)在該重疊區(qū)域內(nèi)的定量將是很好的。 然而，在后者中，它們不重疊，容易看出蛋白質(zhì)濃度的變化如何影響一種蛋白條帶強度，而不影響另一種蛋白質(zhì)的條帶強度。 在這種情況下，定量是不準確的。

確定線性范圍相對容易，可以通過樣品并進行連續(xù)稀釋來實現(xiàn)。 如果線性范圍重疊，則確定要加載的樣品量也同樣容易。 然而，如果范圍不重疊，如評估高表達的看家基因相關(guān)聯(lián)的低豐度蛋白是非常常見的，定量就變得很困難。 此外，如果你感興趣的蛋白被刺激上升或下調(diào)，那么這可能會進一步干擾您嘗試適應(yīng)線性范圍。

如果你的線性范圍不重疊，我們該怎么辦？

但是，有幾個辦法可用。 經(jīng)常被忽視的步驟是改變上樣質(zhì)控。 如果您知道您的蛋白質(zhì)表達水平相對較低，則上樣控制選擇如beta-actin蛋白可能不合適。 在這些情況下，使用細胞器特異性蛋白質(zhì)可能會更有益，如Lamin B1或HSP60，因為它們應(yīng)該表達不是特別高，但是應(yīng)注意確認這些蛋白是表達不會因為處理而發(fā)生改變

第二個選擇是從單一內(nèi)參上樣質(zhì)控轉(zhuǎn)向總蛋白定量，作為質(zhì)控的一種手段。 通過評估整個蛋白范圍，產(chǎn)生更廣泛的動態(tài)范圍。 這些染色包括凝膠和膜染色，并且可以以各種不同的方式成像。 此外，如前所述，該技術(shù)是檢查蛋白分離質(zhì)量和轉(zhuǎn)印效率非常好方法。

最后，可以在成像期間擴大動態(tài)范圍。 膠片動態(tài)范圍很差，曝光時間不準確的問題可能會使事情變得更加復雜。 凝膠和膜在成像系統(tǒng)里面進行成像，如我們的c系列。 諸如c600的成像系統(tǒng)和Azure Sapphire雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)能夠在更寬的動態(tài)范圍內(nèi)進行成像，因此能夠進行線性范圍的檢測。