物種鑒定系列

 

真核生物 18S 基因核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ?/P>

請(qǐng)于-20℃條件下保存，有效期 12 個(gè)月

 

◆ 產(chǎn)品說(shuō)明

 

物種鑒定系列可針對(duì)食品、飼料等樣品中動(dòng)物源性成分的特異核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲

 

線判定結(jié)果。本產(chǎn)品用于真核生物的檢測(cè)，檢出限為 0.1%。

 

◆ 產(chǎn)品組成（48 測(cè)試）

 

 

	021092M
試劑	含量
A-18S-P	1000μL ×1 支
NG-P	100μL ×1 支
PG-18S-P	100μL ×1 支

 

 

◆ 適用儀器

 

熒光 PCR 儀（ABI 7500，CFX 96，Mx 3005P，LineGene9600）等 PCR 擴(kuò)增儀。

 

◆ 自備耗材和儀器

 

①滅菌 1.5mL 或 2.0mL 離心管；②滅菌 0.2mL PCR 管或八聯(lián)管；③冰盒；④移液器（1-10μL，10-100μL，100-1000μL）

 

及配套滅菌吸頭；⑤離心機(jī)；⑥渦旋混勻器；⑦金屬浴。

 

◆ 注意事項(xiàng)

 

1．本試劑檢測(cè)靈敏度高。為了防止污染，實(shí)驗(yàn)要分區(qū)操作。

 

1）第一區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)。

 

2）第二區(qū)：樣本制備區(qū)。

 

3）第三區(qū)：擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)。

 

★ 分區(qū)之間最好進(jìn)行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

 

2. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中穿戴工作服和乳膠手套，使用移液器，試驗(yàn)產(chǎn)生的所有廢棄物及時(shí)處理。

 

3．嚴(yán)格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請(qǐng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)要求在冰上操作。

 

4．反應(yīng)液中的成分對(duì)光敏感，應(yīng)避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，推薦使用前離心 30

 

秒，并按檢測(cè)頻次將反應(yīng)液以適當(dāng)體積分管保存。

 

5．反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增管請(qǐng)置于密封袋內(nèi)丟棄，當(dāng)日清理，開(kāi)蓋易造成氣溶膠污染，禁止開(kāi)蓋。

 

6．不同批號(hào)試劑請(qǐng)勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。

 

◆ 樣品處理

 

參照《SN/T 3730-2013 食品及飼料中常見(jiàn)畜類品種的鑒定方法》或其他標(biāo)準(zhǔn)處理樣品，制備的樣本保存待用。樣品的采集和制備是動(dòng)物源性鑒別的重要步驟，為防止交叉污染，應(yīng)使用一次性消耗品，研缽應(yīng)經(jīng) 160℃干烤

 

2 h，其他不宜干烤或高壓處理的器皿應(yīng)使用 1%次氯酸鈉溶液浸泡。

 

取樣應(yīng)盡量采取肌肉組織，對(duì)于同一批樣品，應(yīng)多點(diǎn)采集合并后，作為一份樣品進(jìn)行均質(zhì)，提取 DNA。

 

采樣過(guò)程應(yīng)快速完成，將采取的樣品迅速放入組織攪碎機(jī)中進(jìn)行均質(zhì)成糜狀，充分混勻，取 0.1 g 充分混勻的樣品，采用液氮研磨或均質(zhì)器均質(zhì)。

 

詳細(xì)步驟請(qǐng)按照標(biāo)準(zhǔn)操作或查閱食安通軟件。

◆ 實(shí)驗(yàn)操作

 

將試劑完全解凍，各組分離心 30s。

 

1.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)，放置于冰盒中進(jìn)行）：

 

若有 N 個(gè)待檢樣品，則參照下表，按照 N+2 個(gè)數(shù)量計(jì)算反應(yīng)液用量（N 個(gè)待檢樣品+1 個(gè)陰性對(duì)照+1 個(gè)陽(yáng)性對(duì)照），渦旋混勻，離心 30s，分裝于 0.2mL PCR 管中。

 

試劑	使用量
A-18S-P	20×(N+2)μL
反應(yīng)液總體積	20×(N+2)μL

 

2．模板制備（樣本制備區(qū)）

 

建議使用試劑配套動(dòng)物源性成分 DNA 提取系列產(chǎn)品，具體過(guò)程詳見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

 

3．添加模板（樣本制備區(qū)，放置于冰盒中進(jìn)行）

 

在步驟 1 中已含有反應(yīng)液的 PCR 管中加入 5μL 模板，順序?yàn)?NG-P、待測(cè)樣品模板、PG-18S-P。渦旋混勻 30s，離心 1min，立即進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。

 

• 擴(kuò)增反應(yīng)（擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)區(qū)）

 

使用熒光定量 PCR 儀，熒光基團(tuán)選擇 FAM，淬滅基團(tuán)選擇 TAMRA。按下列條件設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)：

 

		PCR 循環(huán)					熒光收集位點(diǎn)
	95℃	10 分鐘		1 個(gè)循環(huán)			—
	95℃	15 秒		40 個(gè)循環(huán)			—
	60℃	1 分鐘					※

 

5.基線和閾值設(shè)定基線調(diào)整取 3-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，閾值線應(yīng)超過(guò)陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)

 

◆ 結(jié)果判定

 

檢測(cè)樣品無(wú) Ct 值，曲線為直線或輕微斜線，無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線，可報(bào)告樣品陰性，不含有真核生物或含量低于檢測(cè)限；

 

檢測(cè)樣品 Ct≤35，曲線呈“S”型擴(kuò)增曲線，可直接報(bào)告樣品陽(yáng)性，含有真核生物；檢測(cè)樣品 Ct＞35，可直接報(bào)告樣品陰性，不含有真核生物或含量低于檢測(cè)限。

 

• NG 反應(yīng)為平滑直線，PG 反應(yīng)為“S”型擴(kuò)增曲線，此次檢測(cè)結(jié)果有效，否則無(wú)效。如重復(fù)檢測(cè)結(jié)果仍為無(wú)效，請(qǐng)與技術(shù)支持人員聯(lián)系。

 

 

 

 

 

 

 

陽(yáng)性對(duì)照

 

陰性對(duì)照