蛋白分離、雜交、檢測(cè)、分析

前瞻回顧

鑒于小編在《Azure Biosystems Western Blotting工作流程之實(shí)驗(yàn)方法的選擇》中和大家聊了Western blot的實(shí)驗(yàn)方法選擇，相信大家已經(jīng)將您的western blot 實(shí)驗(yàn)方法選擇好了，那么這期小編和大家聊聊western blot的實(shí)驗(yàn)流程中的那些事。

蛋白分離

電泳準(zhǔn)備？

玻璃配膠板要清洗干凈，以免引起配膠問題，影響蛋白分離

配膠液要充分混勻，凝聚時(shí)間要夠，如膠凝聚不均勻，會(huì)造成膠分辨率差。出現(xiàn)笑臉皺眉條帶

電泳時(shí)，上樣體積和濃度最好保持一致，這樣可以防止出現(xiàn)條帶過寬或者過窄的情況產(chǎn)生

如何選擇膜？

膜上有蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，可結(jié)合從凝膠中轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)。常用的膜是硝酸纖維素膜（NC膜）和PVDF膜。

NC膜

低分子量蛋白檢測(cè)

通常用于化學(xué)發(fā)光法

蛋白剝離效果不理想

PVDF膜

低表達(dá)蛋白結(jié)合能力強(qiáng)

通常用于熒光方法（自發(fā)熒光背景低）

剝離和二次雜交時(shí)，蛋白的截留能力強(qiáng)

如何建立轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)

常用的轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)形式為 “三明治” 結(jié)構(gòu)，凝膠和膜緊密貼合，放在兩張轉(zhuǎn)印濾紙之間，用電極板夾夾住，置于轉(zhuǎn)印buffer中，正負(fù)電極通電后，將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。轉(zhuǎn)印濾紙 （濾紙） 能夠保持均勻一致的壓力，確保膜和凝膠間沒有空隙，并保持轉(zhuǎn)移buffer充盈在“三明治”結(jié)構(gòu)中蛋白完全從凝膠轉(zhuǎn)移至膜上。 

Blot前準(zhǔn)備什么？

當(dāng)優(yōu)化轉(zhuǎn)印設(shè)置、條件及實(shí)驗(yàn)時(shí)，最重要的是確定樣品中所有蛋白是否從膠上完全轉(zhuǎn)移到膜上。使用SelfStain^TM免染膠來顯示膜上的所有蛋白 ，并立即進(jìn)行western blot后續(xù)步驟。 

膜封閉

封閉目的是防止非特異性結(jié)合，降低背景對(duì)目的信號(hào)的干擾。如使用脫脂奶粉做封閉液，最好將脫脂奶粉進(jìn)行濾膜過濾，這樣可以減少后期顆粒背景的產(chǎn)生。

一抗孵育

確保新的一抗?jié)舛冉?jīng)過優(yōu)化。如有確證過的一抗，可嘗試將一抗標(biāo)記熒光染料，直接進(jìn)行一步法Western blot檢測(cè)。

洗膜和二抗孵育

每次孵育后，洗去多余的抗體對(duì)于降低背景信號(hào)至關(guān)重要。熒光方法Western blot中，洗膜還可以去除有自發(fā)熒光的去垢劑。洗膜的時(shí)候如果多張，建議分開進(jìn)行清洗，同時(shí)洗膜液體積不能太少。

化學(xué)發(fā)光檢測(cè)

嘗試不同的底物增加靈敏度和信號(hào)持久性；化學(xué)發(fā)光底物使用前需要平衡至室溫，可以增加酶的活性；數(shù)字成像系統(tǒng)要靈敏度很高。

熒光檢測(cè)

保持所有物品的清潔，確保無背景干擾；印跡膜避光保存；使用背景淬滅板降低背景熒光，增強(qiáng)信噪比。

檢測(cè)

Azure Biosystems c系列成像系統(tǒng)

Azure c 系列成像系統(tǒng)提供 4 款性能卓越的 Western blot 成像系統(tǒng)。可以選擇滿足現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)需求的型號(hào)，當(dāng)需要提升應(yīng)用范圍時(shí)，通過升級(jí)即可完成

分析

AzureSpot分析軟件

AzureSpot 分析軟件作為分析膠和膜的工具，把復(fù)雜的分析變得簡(jiǎn)單化。

1.在樣品上進(jìn)行泳道劃分           2.設(shè)置閾值，檢測(cè)條帶

3.扣除背景，提供有多種背景扣除方法可選4.查看結(jié)果，可作出修改或?qū)θ我鈼l帶邊界進(jìn)行編輯

5.使用標(biāo)準(zhǔn)分子量marker來確定樣品的分子量，或者使用標(biāo)準(zhǔn)品來確定濃度