葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)發(fā)展歷程及測(cè)量原理
瀏覽次數(shù):3342 發(fā)布日期:2017-10-13
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葉綠素?zé)晒猓鳛楣夂献饔醚芯康奶结,得到了廣泛的研究和應(yīng)用。葉綠素?zé)晒獠粌H能反映光能吸收、激發(fā)能傳遞和光化學(xué)反應(yīng)等光合作用的原初反應(yīng)過程,而且與電子傳遞、質(zhì)子梯度的建立及ATP合成和CO2固定等過程有關(guān)。幾乎所有光合作用過程的變化均可通過葉綠素?zé)晒夥从吵鰜?lái),而熒光測(cè)定技術(shù)不需破碎細(xì)胞,不傷害生物體,因此通過研究葉綠素?zé)晒鈦?lái)間接研究光合作用的變化是一種簡(jiǎn)便、快捷、可靠的方法。目前,葉綠素?zé)晒庠诠夂献饔、植物脅迫生理學(xué)、水生生物學(xué)、海洋學(xué)和遙感等方面得到了廣泛的應(yīng)用。
發(fā)展歷史
葉綠素?zé)晒猬F(xiàn)象是由傳教士Brewster首次發(fā)現(xiàn)的。1834年Brewster發(fā)現(xiàn),當(dāng)一束強(qiáng)太陽(yáng)光穿過月桂葉子的乙醇提取液時(shí),溶液的顏色變成了綠色的
互補(bǔ)色——紅色,而且顏色隨溶液的厚度而變化,這是歷史上對(duì)葉綠素?zé)晒饧捌?A target=_blank>重吸收現(xiàn)象的首次記載。后來(lái),Stokes(1852)認(rèn)識(shí)到這是一種光發(fā)射現(xiàn)象,并使用了“fluorescence”一詞。1874年,Müller發(fā)現(xiàn)葉綠素溶液稀釋后,
熒光強(qiáng)度比活體葉子的熒光強(qiáng)得多。盡管Müller提出葉綠素?zé)晒夂凸夂献饔弥g可能存在相反的關(guān)系,但由于他的實(shí)驗(yàn)沒有對(duì)照,實(shí)驗(yàn)條件控制不嚴(yán)格,因此人們并沒有將葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)(瞬變)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)歸功于Müller。
Kautsky是公認(rèn)的葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)者。1931年,Kautsky和Hirsch用肉眼觀察并記錄了葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)現(xiàn)象(Lichtenthaler,1992;Govindjee,1995)。他們將
暗適應(yīng)的葉子照光后,發(fā)現(xiàn)葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度隨時(shí)間而變化,并與CO2的固定有關(guān)(圖3.1)。他們得到的主要結(jié)論如下:1)葉綠素?zé)晒庋杆偕叩阶罡唿c(diǎn),然后下降,最終達(dá)到一穩(wěn)定狀態(tài),整個(gè)過程在幾分鐘內(nèi)完成。2)曲線的上升反映了光合作用的原初
光化學(xué)反應(yīng),不受溫度(0℃和30℃)和
HCN處理的影響。若在最高點(diǎn)時(shí)關(guān)掉光,則熒光迅速下降。3)
熒光強(qiáng)度的變化與CO2的固定呈相反的關(guān)系,若熒光強(qiáng)度下降,則CO2固定增加。這說明當(dāng)熒光強(qiáng)度降低時(shí),較多的光能用于轉(zhuǎn)變成化學(xué)能。4)奇怪的是(照光后)CO2的固定有一個(gè)延滯期,似乎說明“光依賴”的過程對(duì)CO2固定過程的進(jìn)行是必需的。另一個(gè)未得到解釋的現(xiàn)象是若在熒光誘導(dǎo)結(jié)束后關(guān)掉光,則熒光水平的恢復(fù)需要很長(zhǎng)時(shí)間。在Kautsky的發(fā)現(xiàn)之后,人們對(duì)葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)現(xiàn)象進(jìn)行了廣泛而深入的研究,并逐步形成了光合作用熒光誘導(dǎo)理論,被廣泛應(yīng)用于光合作用研究。由于Kautsky的杰出貢獻(xiàn),葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)現(xiàn)象也被稱為Kautsky效應(yīng)(Kautsky Effect)。
量子產(chǎn)量
細(xì)胞內(nèi)的葉綠素分子通過直接吸收光量子或間接通過
捕光色素吸收光量子得到能量后,從
基態(tài)(低能態(tài))
躍遷到
激發(fā)態(tài)(高能態(tài))。由于波長(zhǎng)越短能量越高,故葉綠素分子吸收紅光后,
電子躍遷到最低激發(fā)態(tài);吸收藍(lán)光后,電子躍遷到比吸收紅光更高的
能級(jí)(較高激發(fā)態(tài))。處于較高激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定,在幾百
飛秒(fs,1 fs=10-15 s)內(nèi),通過
振動(dòng)弛豫向周圍環(huán)境輻射熱量,回到最低激發(fā)態(tài)(圖3.2)。最低激發(fā)態(tài)的葉綠素分子可以穩(wěn)定存在幾納秒(ns,1 ns=10-9 s)。
處于較低激發(fā)態(tài)的葉綠素分子可以通過幾種途徑釋放能量回到穩(wěn)定的基態(tài)。能量的釋放方式有如下幾種(圖3.3)(Campbell et al.,1998;Roháček & Barták,1999;Malkin & Niyogi,2000):1)重新放出一個(gè)
光子,回到
基態(tài),即產(chǎn)生熒光。由于部分激發(fā)能在放出熒光光子之前以熱的形式逸散掉了,因此熒光的波長(zhǎng)比
吸收光的波長(zhǎng)長(zhǎng),葉綠素?zé)晒庖话阄挥诩t光區(qū)。2)不放出光子,直接以熱的形式
耗散掉(非輻射
能量耗散)。3)將能量從一個(gè)葉綠素分子傳遞到鄰近的另一個(gè)葉綠素分子,能量在一系列葉綠素分子之間傳遞,最后到達(dá)
反應(yīng)中心,
反應(yīng)中心葉綠素分子通過電荷分離將
能量傳遞給
電子受體,從而進(jìn)行
光化學(xué)反應(yīng)。以上這3個(gè)過程是相互競(jìng)爭(zhēng)的,往往是具有最大速率的過程處于支配地位。對(duì)許多色素分子來(lái)說,熒光發(fā)生在納秒級(jí),而
光化學(xué)發(fā)生在ps級(jí),因此當(dāng)光合生物處于正常的生理狀態(tài)時(shí),
天線色素吸收的光能絕大部分用來(lái)進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng),熒光只占很小的一部分。
活體細(xì)胞內(nèi)由于激發(fā)能從
葉綠素b到
葉綠素a的傳遞幾乎達(dá)到100%的效率,因此檢測(cè)不到葉綠素b熒光。在室溫下,絕大部分(約90%)的活體葉綠素?zé)晒鈦?lái)自PSⅡ的天線色素系統(tǒng),而且光合器官吸收的能量只有約3%~5%用于產(chǎn)生熒光(林世青,1996;Krause & Weis,1991)。
飽和脈沖技術(shù)工作原理
所謂飽和
脈沖技術(shù),就是打開一個(gè)持續(xù)時(shí)間很短(一般小于1 s)的強(qiáng)光關(guān)閉所有的電子門(光合作用被暫時(shí)抑制),從而使葉綠素?zé)晒膺_(dá)到最大。飽和脈沖(Saturation Pulse, SP)可被看作是光化光的一個(gè)特例。光化光越強(qiáng),PS II釋放的電子越多,PQ處累積的電子越多,也就是說關(guān)閉態(tài)的電子門越多,F(xiàn)越高。當(dāng)光化光達(dá)到使所有的電子門都關(guān)閉(不能進(jìn)行光合作用)的強(qiáng)度時(shí),就稱之為飽和脈沖。
打開飽和脈沖時(shí),本來(lái)處于開放態(tài)的電子門將該用于光合作用的能量轉(zhuǎn)化為了葉綠素?zé)晒夂蜔,F(xiàn)達(dá)到最大值。
經(jīng)過充分
暗適應(yīng)后,所有電子門均處于開放態(tài),打開測(cè)量光得到Fo,此時(shí)給出一個(gè)飽和脈沖,所有的電子門就都將該用于光合作用的能量轉(zhuǎn)化為了熒光和熱,此時(shí)得到的葉綠素?zé)晒鉃镕m。根據(jù)Fm和Fo可以計(jì)算出PS II的最大
量子產(chǎn)量Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm,它反映了植物的潛在最大
光合能力。
在光照下光合作用進(jìn)行時(shí),只有部分電子門處于開放態(tài)。如果給出一個(gè)飽和脈沖,本來(lái)處于開放態(tài)的電子門將該用于光合作用的能量轉(zhuǎn)化為了葉綠素?zé)晒夂蜔,此時(shí)得到的葉綠素?zé)晒鉃镕m’。根據(jù)Fm’和F可以求出在照光條件下PSII反應(yīng)中心部分關(guān)閉的情況下的實(shí)際原初光能捕獲效率=ΦPSII=ΔF/Fm’=(Fm’-F)/Fm’,它反映了植物目前的實(shí)際
光合效率。
在光照下光合作用進(jìn)行時(shí),只有部分電子門處于關(guān)閉態(tài),實(shí)時(shí)熒光F比Fm要低,也就是說發(fā)生了
熒光淬滅(quenching)。植物吸收的光能只有3條去路:光合作用、葉綠素?zé)晒夂蜔帷8鶕?jù)
能量守恒:1=光合作用+葉綠素?zé)晒?熱?梢缘贸觯喝~綠素?zé)晒?1-光合作用-熱。也就是說,葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量的下降(
淬滅)有可能是由光合作用的增加或熱
耗散的增加引起的。由光合作用的引起的熒光淬滅稱之為
光化學(xué)淬滅(photochemical quenching, qP);由熱耗散引起的熒光淬滅稱之為非光化學(xué)淬滅(non-photochemical quenching, qN或NPQ)。光化學(xué)淬滅反映了植物光合活性的高低;非光化學(xué)淬滅反映了植物耗散過剩光能為熱的能力,也就是光保護(hù)能力。
光照狀態(tài)下打開飽和脈沖時(shí),電子門被完全關(guān)閉,光合作用被暫時(shí)抑制,也就是說光化學(xué)
淬滅被全部抑制,但此時(shí)熒光值還是比Fm低,也就是說還存在
熒光淬滅,這些剩余的熒光淬滅即為非光化學(xué)淬滅。淬滅系數(shù)的計(jì)算公式為:qP=(Fm’-Fs)/Fv’=1-(Fs-Fo’)/(Fm’-Fo’);qN=(Fv-Fv’)/Fv=1-(Fm’-Fo’)/(Fm-Fo);NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’=Fm/Fm’-1。
當(dāng)F達(dá)到穩(wěn)態(tài)后關(guān)閉光化光,同時(shí)打開遠(yuǎn)紅光(Far-red Light, FL)(約持續(xù)3-5 s),促進(jìn)PS I迅速吸收累積在電子門處的電子,使電子門在很短的時(shí)間內(nèi)回到開放態(tài),F(xiàn)回到最小熒光Fo附近,此時(shí)得到的熒光為Fo’。由于在
野外測(cè)量Fo’不方便,因此野外版的調(diào)制熒光儀(除
PAM-2100和
WATER-PAM)外,多數(shù)不配置遠(yuǎn)紅光。此時(shí)可以直接利用Fo代替Fo’來(lái)計(jì)算qP和qN,盡管得到的參數(shù)值有輕微差異,但qP和qN的變化趨勢(shì)與利用Fo’計(jì)算時(shí)是一致的。由于NPQ的計(jì)算不需Fo’,近10幾年來(lái)得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。