體液黃嘌呤氧化酶活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI體液黃嘌呤氧化酶活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過黃嘌呤氧化酶和過氧化酶酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)中生成的過氧化氫，與顯色染料作用后，產(chǎn)生醌亞胺產(chǎn)物所呈現(xiàn)的吸光峰值的變化，即采用比色法來測定體液樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種動物或人體體液樣品（血液、精液、腦脊液、尿液等）黃嘌呤氧化酶的活性檢測，以及抑制劑篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase；XO；EC1.17.3.2），又稱為黃嘌呤氧化還原酶（xanthine oxidoreductase）是復(fù)合鉬酸黃素酶（molybdoflavoenzyme），是人體中嘌呤分解代謝過程中的終端酶，存在于所有生命體中。在哺乳動物中，主要在肝臟和小腸高度表達(dá)。黃嘌呤氧化酶是一個(gè)單分子多元素構(gòu)成的大分子結(jié)構(gòu)體，分子量為270KD，含有2個(gè)黃素分子、2個(gè)鉬原子、8個(gè)鐵原子，參與呼吸鏈電子傳遞。黃嘌呤氧化酶催化次黃嘌呤的羥基化作用，產(chǎn)生黃嘌呤（xanthine），進(jìn)而氧化為尿酸（uric acid）。此外，黃嘌呤氧化酶可以作為NADH氧化酶，產(chǎn)生超氧陰離子和過氧化氫，影響各種細(xì)胞分子成分，導(dǎo)致細(xì)胞退化和死亡，以及心血管疾病。肝病患者的肝組織中黃嘌呤氧化酶活性1000倍高于正常人水平。黃嘌呤氧化酶缺陷將引起黃嘌呤尿（xanthinuria），導(dǎo)致腎衰竭�；�于底物次黃嘌呤（hypoxanthine），在黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase）的催化下，生成過氧化氫，然后借助過氧化酶（peroxidase）的作用，與對羥基苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid）和氨基安替比林（4-aminoantipyrine）反應(yīng)，形成有色醌亞胺（quinoneimine），通過其吸收峰值的變化（510nm波長），來定量分析黃嘌呤氧化酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI緩沖液（Reagent A） 毫升

YIJI底物液（Reagent B）      毫升

YIJI反應(yīng)液（Reagent C）      毫升

YIJI陰性液（Reagent D）   微升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；YIJI底物液（Reagent B）避免光照；有效保證6月

用戶自備

抗凝管：用于血液采集的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

4℃（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品處理

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

比色皿或酶標(biāo)板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品準(zhǔn)備

選擇一：血漿樣品

• 準(zhǔn)備好肝素或ACD抗凝管（注意：避免使用EDTA抗凝管）
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存

選擇二：血清樣品

1． 準(zhǔn)備好不含抗凝劑的儲存管 

• 抽取1毫升血液，置于儲存管里
• 室溫下，靜置30分鐘，直至血液凝結(jié)
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血清成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存

選擇三：尿液/腦脊液/唾液/精液樣品 

• 準(zhǔn)備好1.5毫升離心管
• 移取1毫升液體到離心管 
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管 
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存

• 測定準(zhǔn)備

• 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長510nm，間隔5分鐘，讀數(shù)3次（共15分鐘），并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；YIJI底物液（Reagent B）避免光照；YIJI緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent B）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent C）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent D）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

• 樣品測定

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent B）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent C）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入50微升待測樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)） 

五、計(jì)算樣品活性

• 酶標(biāo)板測定

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
• 分別移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent A）到96孔板中
• 分別加入xx微升YIJI底物液（Reagent B）
• 分別加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent C）
• 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入xx微升YIJI陰性液（Reagent D）或待測樣品（50微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動酶標(biāo)板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和15分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算：

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 加樣后3秒內(nèi)比色測定
• 測定值由低到高變化；測定可持續(xù)15分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定15分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/50微升（本公司提供 YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 黃嘌呤氧化酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化1微摩爾黃嘌呤至尿酸所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列氧化酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感