YIJI基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）明膠酶譜法電泳分析試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

YIJI基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）明膠酶譜法（gelatin-zymography）電泳分析試劑是一種旨在通過(guò)明膠聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，在分離、蛋白復(fù)性、底物水解、染色等一系列步驟下，觀察并半定量深藍(lán)色背景中的無(wú)色清晰的基質(zhì)金屬蛋白酶條帶，根據(jù)分子量確定特異基質(zhì)金屬蛋白酶及其活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞萃取樣品（動(dòng)物、人體、植物、昆蟲(chóng)等）、培養(yǎng)上清懸液、血清和關(guān)節(jié)滑液或腦脊液等基質(zhì)金屬蛋白酶-2，9，以及13等活性及其抑制劑的檢測(cè)。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作便捷，敏感度高，條帶清晰，重復(fù)性好。

技術(shù)背景

基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一類結(jié)構(gòu)高度同源的分泌型或膜相關(guān)性鋅內(nèi)肽酶的總稱，因含有金屬（鋅、鈣）離子而得名。其功能在于分解細(xì)胞外基質(zhì)成分。迄今為止發(fā)現(xiàn)的MMPs至少有28種，幾乎能降解除多糖以外的全部細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix）成分，同時(shí)參與胚胎發(fā)育、形態(tài)形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、組織再吸收（tissue resorption）、疾病發(fā)生，例如關(guān)節(jié)炎、癌細(xì)胞浸入轉(zhuǎn)移等。根據(jù)降解的底物不同可將MMPs分為4大類：（1）膠原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和蛋白多糖；（2）明膠酶（Ⅳ型膠原酶）：MMP2、MMP9，又稱明膠酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和彈性纖維；（3）基質(zhì)溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11，主要作用于纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈力纖維、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ膠原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金屬蛋白酶：MT₁-MMP、MT₂-MMP、MT₃-MMP，主要作用于明膠、Ⅳ型膠原、MMP2。體內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞并不儲(chǔ)備MMPs，當(dāng)需要MMPs的信號(hào)傳遞到細(xì)胞后才臨時(shí)合成，合成的MMPs以無(wú)活性的酶原（proenzyme）形式分泌到細(xì)胞外，隨后被多種蛋白酶和非蛋白酶水解以及熱處理激活，一種激活的MMPs可激活另一種MMPs，形成瀑布效應(yīng)。明膠酶譜法（gelatin-zymography）電泳分析技術(shù)具有簡(jiǎn)便，無(wú)需抗體，同步觀察多種酶以及活化與否的優(yōu)勢(shì)

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI膠體液（Reagent A） 100毫升

YIJI凝結(jié)液（Reagent B）   3毫升

YIJI促進(jìn)液（Reagent C） 500微升

YIJI膠頂液（Reagent D）  25毫升

YIJI電泳液（Reagent E） 250毫升

YIJI上樣液（Reagent F）   1毫升

YIJI復(fù)性液（Reagent G）  50毫升

YIJI消化液（Reagent H）  50毫升

YIJI染色液（Reagent I） 250毫升

YIJI祛色液（Reagent J） 250毫升

YIJI終止液（Reagent K） 250毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)       1份

保存方式

保存YIJI凝結(jié)液（Reagent B）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； YIJI膠體液（Reagent A）、YIJI促進(jìn)液（Reagent C）、YIJI膠頂液（Reagent D）、YIJI上樣液（Reagent F）、YIJI染色液（Reagent I），避免光照，有效保證6月

用戶自備

無(wú)離子水：用于稀釋濃縮型試劑溶液

1.5毫升離心管：用于樣品處理的容器

15毫升錐形離心管：用于膠體溶液配制的容器

50毫升錐形離心管：用于膠體溶液配制的容器

培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物

電泳儀：用于蛋白樣品電泳分離

平式搖蕩儀：用于孵育和混勻反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，移取50毫升YIJI電泳液（Reagent E）到500毫升容器里，加入450毫升用戶自備的無(wú)離子水，混勻后，標(biāo)記為YIJI電泳工作液。同時(shí)將YIJI膠體液（Reagent A）、YIJI凝結(jié)液（Reagent B）、YIJI促進(jìn)液（Reagent C）和YIJI膠頂液（Reagent D）放進(jìn)25℃恒溫水槽預(yù)熱。然后進(jìn)行下列操作。

• 移出20毫升YIJI膠體液（Reagent A）到50毫升錐形離心管里
• 加入400微升YIJI凝結(jié)液（Reagent B）
• 加入40微升YIJI促進(jìn)液（Reagent C）（注意：如果凝結(jié)過(guò)快，可以適量減少YIJI凝結(jié)液（Reagent B）和YIJI促進(jìn)液（Reagent C））
• 混勻后，即刻移入玻璃槽，避免氣泡
• 在室溫下孵育45分鐘，或直至膠體凝結(jié)
• 移出5毫升YIJI膠頂液（Reagent D）到15毫升錐形離心管里
• 加入100微升YIJI凝結(jié)液（Reagent B）
• 加入10微升YIJI促進(jìn)液（Reagent C）（注意：如果凝結(jié)過(guò)快，可以適量減少YIJI凝結(jié)液（Reagent B）和YIJI促進(jìn)液（Reagent C））
• 混勻后，即刻移入玻璃槽，避免氣泡
• 插入0.75毫米厚的10孔梳
• 在室溫下孵育45分鐘，或直至膠體凝結(jié)
• 將玻璃槽移入到電泳槽里
• 加入適量的含有YIJI電泳液（Reagent E）的YIJI電泳工作液
• 小心拔去10孔梳
• 用吸管或1毫升槍頭沖洗樣品孔備用
• 從－70℃冰箱里取出待測(cè)樣品（注意：樣品須澄清；參見(jiàn)注意事項(xiàng)3）
• 移取10微升樣品（20微克總量）到1.5毫升離心管
• 加入10微升YIJI上樣液（Reagent F），混勻
• 室溫下靜置10分鐘
• 小心移取20微升樣品到玻璃槽的樣品孔里（包括用戶自備的蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣）
• 電泳運(yùn)行1至2小時(shí)，電壓為125伏，直至染料前沿到達(dá)膠底處
• 關(guān)閉電源，取出玻璃板，小心拆開(kāi)，避免損壞膠體
• 放進(jìn)塑料盒
• 加入90毫升用戶自備的無(wú)離子水到塑料盒里
• 加入10毫升YIJI復(fù)性液（Reagent G）
• 室溫下，平放在平式搖蕩儀上孵育1小時(shí)，速度為50RPM
• 小心倒掉復(fù)性液
• 加入90毫升用戶自備的無(wú)離子水到塑料盒里
• 加入10毫升YIJI消化液（Reagent H）
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里，在平式搖蕩儀上孵育20小時(shí)，速度為50RPM（注意：如果酶活性過(guò)低，可以延長(zhǎng)孵育時(shí)間至40小時(shí)）
• 小心倒掉消化液
• 加入50毫升用戶自備的無(wú)離子水到塑料盒里
• 加入50毫升YIJI染色液（Reagent I），混勻
• 室溫下，平放在平式搖蕩儀上孵育60分鐘，速度為50RPM
• 小心倒掉染色液
• 加入50毫升用戶自備的無(wú)離子水到塑料盒里
• 加入50毫升YIJI祛色液（Reagent J），混勻
• 室溫下，平放在平式搖蕩儀上孵育30分鐘，速度為50RPM，或直至可見(jiàn)藍(lán)色背景下白色清晰的條帶（注意：避免過(guò)度去色）
• 小心倒掉祛色液
• 加入50毫升YIJI終止液（Reagent K）
• 進(jìn)行拍照記錄或成像儀處理和半定量分析：

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為5次（45個(gè)樣品）操作 
• 操作時(shí)，須戴手套
• 樣品準(zhǔn)備要點(diǎn)如下：
  • 必須澄清，至關(guān)重要：4℃高速離心5分鐘，速度為10000g，置于－70℃保存待測(cè)
  • 樣品中避免使用EDTA、EGTA等二價(jià)陽(yáng)離子鰲和劑以及巰基乙醇和DTT等
  • 樣品中避免使用硫醇抑制劑（THIOL INHIBITOR）
  • 由于TIMP等天然抑制劑的存在，血清樣品中的基質(zhì)金屬蛋白酶活性很低，可以使用活化劑（建議使用YIJI膠原酶潛酶活化劑（APMA）－YIJI12197）
  • 如果驗(yàn)證樣品中基質(zhì)金屬蛋白酶，可以使用抑制劑EDTA對(duì)照
  • 避免培養(yǎng)細(xì)胞上清樣品顯示黃色，表明已經(jīng)過(guò)于酸性，須調(diào)整pH為中性方可使用
• 膠體和膠頂配制前，須25℃預(yù)熱相關(guān)試劑
• 電泳前注意清洗樣品孔
• 電泳運(yùn)行，注意安全
• 染色時(shí)，避免光照
• 染色后顯示的亮帶PRO－MMP9（92Kd）、淺帶MMP9（82Kd）、亮帶PRO－MMP2（72Kd）、亮帶MMP2（62Kd）的條帶：在深藍(lán)色背景下的白色條帶
• 有時(shí)會(huì)出現(xiàn)多條帶（multiple bands），表明酶的降解產(chǎn)物
• 本公司提供系列基質(zhì)金屬蛋白酶酶譜檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定條帶清晰