說到基因編輯，大家都會想起CRISPR技術(shù)。這個當(dāng)年名聲大噪的技術(shù)，現(xiàn)今依舊熱度不減，尤其是我們的CRISPR大神張鋒，近期發(fā)表的文章頻頻亮相于知名雜志，又引起一片熱議。時過境遷，CRISPR技術(shù)并沒有銷聲匿跡，一直在線。但任何事物包括技術(shù)有利就有弊，CRISPR技術(shù)當(dāng)然也毫不例外。

CRISPR技術(shù)就是這么好用！

http://<iframe frameborder="0" width="640" height="498" src="https://v.qq.com/iframe/player.html?vid=j0172my5b5o&tiny=0&auto=0" allowfullscreen></iframe>

火了四年之久的技術(shù)，耳熟能詳?shù)膬?yōu)勢顯而易見：摒棄了對于ES細(xì)胞的依賴，CRISPR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對大鼠、豬、猴、斑馬魚等多種物種的編輯；CRISPR技術(shù)依賴于Cas9和sgRNA實(shí)現(xiàn)“精準(zhǔn)”切割，簡化實(shí)驗步驟，大大縮短實(shí)驗周期。周期短、工作量小，隨之而來的就是費(fèi)用的降低。綜上，性價比高的技術(shù)當(dāng)然當(dāng)仁不讓的會一直火。

CRISPR技術(shù)也有缺點(diǎn)？

CRISPR技術(shù)自問世以來，被應(yīng)用至世界各地眾多實(shí)驗室中進(jìn)行科學(xué)研究，在享受其優(yōu)勢的同時，它的弊端也是眾所周知：sgRNA與Cas9蛋白這哥倆，并不是時時刻刻都兢兢業(yè)業(yè)工作的，誰還沒有倦怠的時候呢？本應(yīng)該精準(zhǔn)定位的sgRNA也有走眼的時候，本應(yīng)該識別標(biāo)準(zhǔn)PAM序列 的Cas9蛋白，也偶爾不走心，結(jié)果就是脫靶，影響了編輯的效率。

有“病”不可怕，關(guān)鍵是“對癥下藥”？

醫(yī)生治病講究對癥下藥，科研思路也不例外。找出原因解決問題，既然是sgRNA和Cas9蛋白出現(xiàn)了毛病，那么我們就針對不同病癥采取不同方式：

優(yōu)化sgRNA

（1）改變自我：改變sgRNA 的長度，截斷5' 端的2-3 個堿基或在識別序列前加2 個鳥嘌呤，切割活性不變， 脫靶率降低5000 倍。

（2）提升自我：增加sgRNA 的穩(wěn)定性。如在gRNA 中增加一對A-U 堿基配對等方法。此外， 有研究表明Cas9 直系同源酶對某些位點(diǎn)的特異性較SpCas9 高，這無疑為提高特異性提供了一條新思路。

提高Cas9蛋白自身特異性

    專一性對于家庭是很重要，而對于CRISPR技術(shù)也是很重要。專一性一方面與自身有關(guān)，另一方面也與環(huán)境的誘惑有關(guān)，因此對于Cas9蛋白，我們要從內(nèi)和外兩個因素去考慮。

（1） 擦亮眼睛，辨認(rèn)出誰是你的Mr/Mrs Right：增強(qiáng)Cas9 蛋白對標(biāo)準(zhǔn)PAM 序列的識別能力，突變體D1135E對標(biāo)準(zhǔn)PAM 的識別更加特異，從而降低因識別非標(biāo)準(zhǔn)PAM 序列而引起脫靶。

（2）與對的人相親相愛就好，不要老是沾花惹草：將Cas9蛋白進(jìn)行定點(diǎn)突變形成eSpCas9和SpCas9-HF1，突變體減弱了Cas9 蛋白與DNA 的非特異性結(jié)合的能力，增強(qiáng)靶向序列與Cas9 蛋白結(jié)合的競爭力。

（3）減少外界誘惑：調(diào)控Cas9 蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)量。通過使用誘導(dǎo)型啟動子、插入4-HT 依賴的內(nèi)含肽等方法構(gòu)建誘導(dǎo)型Cas9 蛋白，減少基因組暴露于Cas9 與sgRNA 復(fù)合體的時間， 即減少Cas9 與非靶向序列的結(jié)合概率，進(jìn)而降低脫靶率。

（4）斷舍離：僅保留其核酸識別能力，斷除其核酸內(nèi)切酶的活性。當(dāng)然對于自身也是必須的：降低HNH 或RuvC 結(jié)構(gòu)域功能的突變體H840A 和D10A；構(gòu)建使Cas9 蛋白喪失核酸內(nèi)切酶活性，借助其他核酸內(nèi)切酶實(shí)現(xiàn)基因編輯的CRISPRi和FokⅠ-dCas9。

百奧賽圖殺手锏——Southern blot檢測金標(biāo)準(zhǔn)

sgRNA設(shè)計嚴(yán)謹(jǐn)

舍棄可能脫靶到有功能基因組序列的sgRNA

純RNA注射

縮短Cas9蛋白和sgRNA的作用時間

Southern blot檢測

對大量數(shù)據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，采用ES細(xì)胞方式制備，隨機(jī)插入概率約為20%，采用CRISPR/Cas9技術(shù)，大約有32%的概率有隨機(jī)插入。而這32%中有14%的隨機(jī)插入無法依靠交配傳代去除，排除隨機(jī)插入的金標(biāo)準(zhǔn)是Southern blot。百奧賽圖嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)，堅持進(jìn)行Southern blot檢測，確保基因編輯獲得的動物無隨機(jī)插入。

Southern雜交的目的是為了檢測目的基因的插入位置及拷貝數(shù)量。Southern blot雜交是進(jìn)行基因組DNA特定序列定位的方法，其操作過程：利用電泳分離經(jīng)酶消化后的DNA片段，然后再將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的DIG標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。  

參考：

[1] Cho S W, Kim S, Kim Y, et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases[J]. Genome research, 2014, 24(1): 132-141.

[2] Kleinstiver B P, Prew M S, Tsai S Q, et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities[J]. Nature, 2015, 523(7561): 481.

[3] Terao M, Tamano M, Hara S, et al. Utilization of the CRISPR/Cas9 system for the efficient production of mutant mice using crRNA/tracrRNA with Cas9 nickase and FokI-dCas9[J]. Experimental animals, 2016, 65(3): 275-283.

[4] Müller M, Lee C M, Gasiunas G, et al. Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome[J]. Molecular Therapy, 2016, 24(3):636–644.

[5] Qi L, Larson M, Gilbert L, et al. Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression[J]. Cell, 2013, 152(5):1173.

[6] Luke A. Gilbert, Matthew H. Larson, Morsut L, et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes[J]. Cell, 2013, 154(2):442.

[7] Hsu P D, Scott D A, Weinstein J A, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases[J]. Nature Biotechnology, 2013, 31(9):827-32.

[8] Fu Y, Sander J D, Reyon D, et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs[J]. Nature Biotechnology, 2014, 32(3):279.

[9] Kleinstiver B P, Vikram P, Prew M S, et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 variants with undetectable genome-wide off-targets:[J]. Nature, 2016, 529(7587):490-495.

[10] Slaymaker I M, Gao L, Zetsche B, et al. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity[J]. Science, 2016, 351(6268):84.

[11] Chiang T W W, Sage C L, Larrieu D, et al. CRISPR-Cas9 D10A nickase-based genotypic and phenotypic 

screening to enhance genome editing[J]. Scientific Reports, 2016, 6:24356.

[12] Pan Y, Shen N, Jungklawitter S, et al. CRISPR RNA-guided FokI nucleases repair a PAH variant in a phenylketonuria model[J]. Scientific Reports, 2016, 6:35794.

制作：

MIT麥戈文腦科學(xué)研究所

張鋒

Sputnik動畫