原核表達(dá)中因?yàn)楦鞣N內(nèi)在和外在因素，外源蛋白表達(dá)過(guò)程中多數(shù)會(huì)形成不可溶形式的包涵體。由于包涵體產(chǎn)量高、穩(wěn)定性好、容易純化等，包涵體蛋白已成為規(guī)模化制備蛋白產(chǎn)品的重要途徑。包涵體雖然有如此好的優(yōu)點(diǎn)，但卻沒(méi)有生物活性，為了達(dá)到這一重要目標(biāo)，各種復(fù)性機(jī)理及策略被研發(fā)出來(lái)，但是往往沒(méi)有一種通用的策略，而是需要結(jié)合表達(dá)蛋白的性質(zhì)進(jìn)行多次的嘗試才能獲得成功。

圖片來(lái)自麻省理工學(xué)院The Jonathan King Lab http://web.mit.edu/king-lab/www/research/Scott/Scott-Research.html

  復(fù)性包涵體通常的步驟是洗滌—溶解—復(fù)性：洗滌去除了包涵體中的雜質(zhì)后基本能得到高純度的重組蛋白，再用強(qiáng)變性劑進(jìn)行溶解，此時(shí)用到的多數(shù)是高濃度的尿素或鹽酸胍，最后進(jìn)行各種方法的復(fù)性，將強(qiáng)變性劑的濃度盡可能降低，得到有正確空間結(jié)構(gòu)的重組蛋白。

  復(fù)性常用的經(jīng)典方法有三類：稀釋復(fù)性法（使用率最高）、透析復(fù)性法、超濾復(fù)性法。隨著技術(shù)的發(fā)展，許多新型方法也被開發(fā)，如高流體靜壓復(fù)性法（HHP）、色譜法、高壓復(fù)性法、反膠束復(fù)性法、沸石復(fù)性法、多壁碳納米管復(fù)性法、三相分離復(fù)性法等。

  復(fù)性就是用外界方法促進(jìn)蛋白進(jìn)行正確折疊的過(guò)程，那么到底是什么影響了蛋白在復(fù)性過(guò)程中的折疊呢？研究表明，復(fù)性成功與否的主要影響因素還是蛋白質(zhì)的自身性質(zhì)，如等電點(diǎn)、分子內(nèi)二硫鍵、蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成等。

1、等電點(diǎn)。蛋白的等電點(diǎn)pI值等于能讓其解離成陽(yáng)離子和陰離子的程度相等使分子呈電中性的溶液pH值。當(dāng)?shù)鞍姿�處溶液pH=pI時(shí)，蛋白呈電中性，容易形成不穩(wěn)定態(tài)聚集析出。在常規(guī)的鹽酸胍/尿素溶解的包涵體復(fù)性過(guò)程中，pI值小于6.0的蛋白更易被成功復(fù)性。

2、分子內(nèi)二硫鍵。如果蛋白復(fù)性時(shí)能形成正確的二硫鍵，對(duì)復(fù)性的成功率會(huì)有很大的改善。因?yàn)榇竽c桿菌胞內(nèi)的還原環(huán)境會(huì)抑制二硫鍵形成從而形成大量錯(cuò)配的二硫鍵，所以對(duì)于有二硫鍵的蛋白在復(fù)性過(guò)程中需要加入氧化還原對(duì)（通常采用GSSH/GSSG）來(lái)控制復(fù)性的環(huán)境的氧化還原電勢(shì)以促進(jìn)正確二硫鍵的形成。

3、蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成對(duì)復(fù)性過(guò)程也有一定程度的影響，但是不是主要因素。例如α螺旋和β折疊的比例增加會(huì)對(duì)復(fù)性的回收率產(chǎn)生不利影響，而轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的比例增加則會(huì)起到一定的促進(jìn)作用。

另外，環(huán)境因素對(duì)復(fù)性過(guò)程也有一定影響，對(duì)不同的蛋白進(jìn)行不同條件的組合嘗試是很有必要的。

1、蛋白的濃度。復(fù)性的過(guò)程可以用如下的公式表示，其中D為變性蛋白，I為折疊中間體，N為天然構(gòu)象蛋白，A為聚合體。反應(yīng)①通常很迅速，反應(yīng)②比較慢是折疊過(guò)程的限速步驟，反應(yīng)③是不可逆的二級(jí)反應(yīng)，在復(fù)性過(guò)程中需要盡量使變性蛋白濃度降低能，盡可能降低反應(yīng)③的速率從而促進(jìn)蛋白的正確折疊。

2、復(fù)性緩沖液pH。通常復(fù)性緩沖液的pH在7.0以上，如此可防止自由硫醇的質(zhì)子化影響二硫鍵的正確配對(duì)，以8.0~9.0最為合適；

3、復(fù)性溫度。復(fù)性過(guò)程中反應(yīng)溫度越高反應(yīng)速率越快，會(huì)提高蛋白復(fù)性的速率，而由此引起的二硫鍵易錯(cuò)配、聚集體容易大量形成也會(huì)大大降低復(fù)性蛋白的活性及復(fù)性回收率，故復(fù)性溫度一般選擇在常溫或更低的溫度。

4、復(fù)性時(shí)間。相對(duì)而言，結(jié)構(gòu)越復(fù)雜、分子間次級(jí)鍵越多越復(fù)雜的蛋白，需要越長(zhǎng)的復(fù)性時(shí)間使其形成正確的折疊。

  復(fù)性過(guò)程一般會(huì)加入一些常規(guī)物質(zhì)輔助復(fù)性，如氧化還原對(duì)（通常采用GSSH/GSSG）、低濃度尿素等，其他一些類型如低濃度變性劑、氨基酸、糖類、表面活性劑、多聚物、蛋白的輔因子、分子伴侶等物質(zhì)也可促進(jìn)包涵體的復(fù)性。

1、低濃度變性劑如尿素、鹽酸胍可以有效防止變性蛋白的分子間疏水作用力，從而抑制聚集體的形成。

2、L-Arg可以特異性結(jié)合于錯(cuò)配二硫鍵及錯(cuò)誤的折疊結(jié)構(gòu)，使錯(cuò)誤折疊的分子變得不穩(wěn)定推動(dòng)其向正確折疊的方向進(jìn)行。

3、糖類如環(huán)糊精與分子伴侶有相似的構(gòu)象，具有疏水性空腔，可結(jié)合變性蛋白多肽鏈的疏水性位點(diǎn)從而抑制其聚集失活，促進(jìn)蛋白進(jìn)行正確的折疊。

4、表面活性劑可以捕獲非天然狀態(tài)的蛋白形成復(fù)合物，起到阻止蛋白凝聚的作用，從而抑制折疊中間體的聚集，如SDS、磺基甜菜堿，但SDS只適用于某些蛋白，對(duì)某些蛋白的復(fù)性可能會(huì)起到不利的作用。

5、一些多聚物如PEG具有脂肪鏈結(jié)構(gòu)，它可以通過(guò)結(jié)合到折疊中間體的非極性區(qū)域來(lái)組織中間體的聚集，從而促進(jìn)蛋白的復(fù)性。

6、蛋白的輔因子如二價(jià)離子Zn²⁺、Cu²⁺可通過(guò)穩(wěn)定折疊中間體從而促進(jìn)蛋白的復(fù)性。

7、分子伴侶是原核和真核生物自身能表達(dá)的一類促進(jìn)蛋白折疊的蛋白，分子伴侶的添加或共表達(dá)可促進(jìn)外源表達(dá)蛋白的正確折疊，分子伴侶主要通過(guò)結(jié)合蛋白的疏水性區(qū)域，防止蛋白形成聚集體和錯(cuò)誤配對(duì)。

  包涵體蛋白的復(fù)性方法選擇和添加物的選擇，應(yīng)結(jié)合蛋白本身的性質(zhì)。例如對(duì)不含二硫鍵的蛋白復(fù)性體系中可加入DTE（Dithioerythritol），對(duì)于含二硫鍵的蛋白需加入氧化還原對(duì)如3 mM還原型和1 mM氧化型谷胱甘肽。對(duì)處于活性態(tài)時(shí)需要金屬離子的蛋白進(jìn)行復(fù)性時(shí)則要避免體系中加入EDTA等螯合劑，而需要添加對(duì)應(yīng)的金屬離子。另外，對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行復(fù)性是一個(gè)很復(fù)雜的過(guò)程，對(duì)某些外界條件需要進(jìn)行逐步優(yōu)化，多次嘗試才能得到最好的復(fù)性產(chǎn)率。