如何選擇合適的濃縮離心管？
一提起蛋白質(zhì)濃縮、更換緩沖液，我們都會(huì)想起超濾。這是一種我們都很熟悉的膜分離技術(shù)。它可用來分離溶液中極小的顆粒和溶解的分子。這種方法的最大特點(diǎn)是操作簡便，只需要濃縮離心管和離心機(jī)，即可圓滿完成我們的任務(wù)。
與層析、透析等方法相比，超濾對被處理的分子更加溫和。它不需要有機(jī)萃取，就不會(huì)導(dǎo)致蛋白變性。這種方法非常高效，可同時(shí)濃縮和純化分子。操作可在低溫（比如冷庫）下進(jìn)行。另外，快速、便宜，也是許多人青睞它的原因。
濃縮離心管的操作很簡單。選擇適當(dāng)?shù)臐饪s離心管，加入待處理的樣本，按照離心管的指示進(jìn)行離心操作，最后回收截留的樣本。在離心力的作用下，溶液中的小分子溶質(zhì)和溶劑透過超濾膜，被收集在濾過液收集瓶中，而大分子溶質(zhì)被超濾膜截留在濃縮離心管中。這種分離的主要依據(jù)是分子大小，但分子形狀和電荷等其他因素也會(huì)有影響。
一般來說，超濾的回收率可達(dá)90%以上。樣本損失大多是由于濾膜表面和容器表面的非特異性吸附引起的。因此，選擇口碑好、高品質(zhì)的濃縮離心管非常重要。Pall作為過濾方面的老牌公司，提供了多種濃縮離心管，可對50 μl到60 ml的樣本進(jìn)行高效的濃縮和脫鹽。它配備了Omega（改良的聚醚砜）膜，確保低的非特異性吸附和高的回收率。當(dāng)然，這個(gè)的前提是你選對了濃縮離心管。
如何選擇濃縮離心管
1. 按體積
Pall提供了4個(gè)系列的濃縮離心管，適合處理不同體積的樣本。你可以根據(jù)你的樣本量來選擇。不過，如果樣本濃度低體積大，可以選擇較小容積的濃縮離心管多次重復(fù)加樣離心。
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產(chǎn)品 |
樣本體積 |
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Nanosep® 濃縮離心管 |
< 0.5 mL |
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Microsep™ Advance 濃縮離心管 |
0.5-5.0 mL |
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Macrosep® Advance 濃縮離心管 |
5-20 mL |
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Jumbosep™ 濃縮離心管 |
20-60 mL |
2. 選擇適當(dāng)?shù)慕亓舴肿恿浚∕WCO）
一旦樣本體積確定，下一步就是選擇適當(dāng)?shù)腗WCO。對于蛋白質(zhì)而言，建議所選濾膜的MWCO是欲截留分子大小的1/6-1/3。通常，截留孔徑越小，流速越慢，但截留比例更大。因此，如果流速是主要的考慮因素，建議選擇MWCO為1/3的濾膜；如果重點(diǎn)考慮截留比例，那么最好選擇更致密的膜。
友情提示一下，超濾膜對分子的截留是由多個(gè)因素決定的。在截留分子量之外，你還有必要考慮分子形狀、電荷、樣本濃度、樣本組成及操作條件。也許，線性的DNA分子溜走了，而球狀的分子卻被保留下來�？傊�，根據(jù)下表來選擇MWCO就基本沒錯(cuò)了。為了防止大家拿錯(cuò)管子，Pall還貼心地將不同MWCO的濃縮離心管設(shè)置成不同的顏色，以方便識(shí)別。
核酸應(yīng)用的MWCO選擇
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MWCO |
堿基對（雙鏈） |
堿基（單鏈） |
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3K |
16-32 bp |
32-65 bs |
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5K |
25-50 bp |
50-95 bs |
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10K |
50-145 bp |
95-285 bs |
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30K |
145-285 bp |
285-570 bs |
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50K |
240-475 bp |
475-950 bs |
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100K |
475-1450 bp |
950-2900 bs |
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300K |
1450-2900 bp |
2900-5700 bs |
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1000K |
4800-9500 bp |
> 9500 bs |
蛋白應(yīng)用的MWCO選擇
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MWCO |
膜額定的孔徑大小 |
生物分子的大小 |
生物分子的分子量 |
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3K |
- |
- |
10K-20K |
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5K |
- |
- |
15K-30K |
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10K |
- |
- |
30K-90K |
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30K |
- |
- |
90K-180K |
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50K |
5 nm |
15-30 nm |
150K-300K |
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100K |
10 nm |
30-90 nm |
300K-900K |
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300K |
35 nm |
90-200 nm |
900K-1800K |
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1000K |
100 nm |
300-600 nm |
> 3000K |
濃縮離心管的應(yīng)用
濃縮
這是大家都很熟悉的應(yīng)用。超濾可很方便地濃縮經(jīng)過稀釋的蛋白質(zhì)或DNA/RNA樣本。它很溫和，不會(huì)打斷長達(dá)100 kb的DNA，也不會(huì)導(dǎo)致蛋白酶活的損失，同時(shí)也很高效，回收率通常高于90%。
之前，美國McGuire VA medical Center的Katrina Stumpf曾與我們分享了她使用Microsep濃縮離心管的經(jīng)驗(yàn)。她利用這些裝置來濃縮一種小肽。操作過程中，她發(fā)現(xiàn)甘油了影響濃縮。之后，她先使用MWCO較大的裝置，接著將濾過液加到MWCO較小的裝置上。雖然耗時(shí)長一些，但是順利完成了濃縮任務(wù)。她認(rèn)為Microsep濃縮離心管簡便易用，操作手冊詳細(xì)，信息量大。
脫鹽和緩沖液交換
超濾帶來了一種方便而高效的方法，可去除和交換溶液中的鹽、去除變性劑、分離復(fù)合分子、去除低分子量組分，或者快速改變離子或者pH環(huán)境。比如在用兩種或兩種以上的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切時(shí)，有時(shí)找不到通用的酶切緩沖液，就可以借助濃縮離心管，更換緩沖液。
組分分離
當(dāng)然，超濾無法完全分離兩種分子量接近的分子。為了有效分離，待分離分子的分子量至少要相差一個(gè)數(shù)量級(jí)（10X）。對于PCR產(chǎn)物的純化和回收，超濾就很適合。PCR反應(yīng)混合物里含有多種鹽、游離的核酸、甘油、蛋白和引物，因此大多數(shù)的下游應(yīng)用都要求對PCR產(chǎn)物進(jìn)行某種純化。超濾的方法快速，操作少，產(chǎn)率高，也不損傷DNA。
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濃縮離心管
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