細胞鈣離子濃度比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

細胞鈣離子濃度比色法定量檢測試劑是一種旨在通過鄰甲酚酞絡(luò)合酮，在堿性條件下與鈣離子反應(yīng)產(chǎn)生紫藍色復(fù)合物，在分光光度儀下通過吸光峰值的變化，即采用比色法來測定樣品中總鈣離子濃度的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞（動物、人體等）裂解萃取樣品中總鈣離子的濃度檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測敏感。

技術(shù)背景

鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì)，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣，其構(gòu)成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進一步分成具有活性的復(fù)合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。鈣的檢測包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技術(shù)，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求。鄰甲酚酞絡(luò)合酮（o-cresolphthalein complexone；CPC）比色法是一種穩(wěn)定、簡便、準(zhǔn)確的鈣檢測技術(shù)。鈣與鄰甲酚酞絡(luò)合酮，在堿性條件下反應(yīng)產(chǎn)生紫藍色復(fù)合物，在分光光度儀下通過吸光峰值的變化（波長570nm），來定量測定細胞鈣的總濃度。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

OH^-

  Ca^＋＋  +  o-cresolphthalein complexone   →    violet complex dye

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）     120毫升

裂解液（Reagent B）  5毫升

緩沖液（Reagent C） 20毫升

反應(yīng)液（Reagent D）     2.5毫升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）    500微升

產(chǎn)品說明書     1份

保存方式

保存在4℃冰箱里；緩沖液（Reagent C）、反應(yīng)液（Reagent D）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品配制和樣品保存的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

微型臺式離心機：用于樣品制備

比色皿：用于反應(yīng)的容器

分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

• 樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好25cm²細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1 X 10⁶細胞）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入200微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好上述制備的待測樣品，置于冰槽里備用
• 設(shè)定好分光光度儀：波長570nm，并置零 
• 準(zhǔn)備好5個1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號管
• 分別加入100微升緩沖液（Reagent C）到2至5號管
• 移取200微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1號管，混勻
• 小心移取100微升1號管的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到2號管，混勻
• 小心移取100微升2號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到3號管，混勻
• 小心移取100微升3號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

三、比色測定

• 移取800微升緩沖液（Reagent C）到新的1毫升比色皿
• 加入100微升反應(yīng)液（Reagent D）
• （選擇步驟）放進分光光度儀，置零
• （選擇步驟）取出比色皿
• 加入100微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測樣品 
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 室溫下孵育5分鐘，避免光照
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)（OD）
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位（OD）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)鈣濃度（毫摩爾/升）
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)鈣濃度（毫摩爾/升）
• 計算樣品實際鈣濃度（毫摩爾/升）

【根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)鈣濃度（毫摩爾/升） X 樣品稀釋倍數(shù)】＝毫摩爾/升

注意事項

• 本產(chǎn)品為25次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)液
• 操作時，須戴手套
• 避免使用EDTA等處理樣品
• 建議樣品保存在－70℃冰箱里
• 系統(tǒng)操作過程中，標(biāo)準(zhǔn)液測定只需1次
• 孵育反應(yīng)完成后即刻進行比色測定
• 如果樣本鈣離子過低，可以增加孵育時間至30分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 如果用戶沒有匹配的濾波器，可以使用570nm至600nm之間的任一波長
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 檢測范圍在5微摩爾/升至0.5毫摩爾/升鈣濃度范圍：參考標(biāo)準(zhǔn)曲線如下 

• 如果用戶需要檢測1至4毫摩爾/升鈣濃度，請購買相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液即可
• 本公司提供系列鈣生化檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感