組織溶酶體脂酶（酸性脂酶）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

組織溶酶體脂酶（酸性脂酶）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過溶酶體脂酶反應(yīng)系統(tǒng)中，在選擇性抑制劑存在與否的情況下，底物膽固醇油酸酯水解后的游離脂肪酸，與醋酸銅反應(yīng)后的藍(lán)綠色產(chǎn)物，呈現(xiàn)吸光峰值的變化，即采用比色法來測(cè)定組織裂解萃取樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解樣品（動(dòng)物、人體、昆蟲等）溶酶體脂酶的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

 

溶酶體酸性脂酶（lysosomal acid lipase；LAL；EC3.1.1.13），又稱為酸性膽固醇酯水解酶（acid cholesteryl ester hydrolase），是脂蛋白代謝中的水解酶（hydrolase）之一，含有372氨基酸的糖蛋白，存在于除紅細(xì)胞外的所有組織細(xì)胞中的溶酶體內(nèi)。在酸性環(huán)境下，通過水解膽固醇酯（cholesterol ester）和甘油三酯（triacylglycerols）鍵，以降解細(xì)胞內(nèi)的脂蛋白，釋放出游離脂肪酸，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的脂類代謝，尤其是膽固醇合成和甘油三酯代謝。溶酶體脂酶缺陷將導(dǎo)致伍爾曼氏�。╓olman disease）和膽固醇酯儲(chǔ)積�。–holesteryl Ester Storage Disease）。溶酶體脂酶具有治療動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis）和外周血管性疾病的潛力。基于底物膽固醇油酸酯（cholesterol oleate），在溶酶體酸性脂酶特異性抑制劑氯丙嗪（chlorpromazine）存在與否的情況下，通過溶酶體酸性脂酶的水解催化，產(chǎn)生游離脂肪酸油酸（oleate），繼而與生色試劑醋酸銅反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)綠色銅鹽復(fù)合物，在分光光度儀下，其吸光值的變化（715nm 波長），來定量測(cè)定溶酶體酸性脂酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

lysosomal acid lipase

cholesterol oleate  +  H2O      →      cholesterol  +  oleate

chlorpromazine（+/—）

 

 oleate  +  cupric acetate/pyridine      →     cupric salt

           

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）    20毫升

緩沖液（Reagent C）  50毫升

底物液（Reagent D）   5毫升

稀釋液（Reagent E）    50毫升

顯色液（Reagent F）  10毫升

專性液（Reagent G）     1毫升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）     1毫升

產(chǎn)品說明書      1份

 

 

保存方式

 

保存在4℃冰箱里，稀釋液（Reagent E）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）具有揮發(fā)性和毒性，注意密閉瓶蓋和操作安全；有效保證3月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

2毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 樣品準(zhǔn)備

 

• 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個(gè)液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
• 加入1毫升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻組織顆粒群
• 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織細(xì)胞（約20至40下）
• 將所有組織細(xì)胞勻漿物移入1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為800g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的1.5毫升離心管 
• 放進(jìn)4℃微型離心機(jī)離心15分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒 
• 加入500微升緩沖液（Reagent C）
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 測(cè)定準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如組織裂解樣品等），置于冰槽里
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長715nm，使用稀釋液（Reagent E）置零 
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

三、標(biāo)準(zhǔn)樣品配制

 

• 準(zhǔn)備好4個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至4號(hào)管
• 分別加入200微升稀釋液（Reagent E）到2至4號(hào)管
• 移取400微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到1號(hào)管
• 小心移取200微升1號(hào)管的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到2號(hào)管，混勻
• 小心移取200微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到3號(hào)管，混勻
• 將1至4號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

 

管號(hào)	稀釋液（Reagent E）	標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）	測(cè)定體系標(biāo)準(zhǔn)油酸濃度
1	－	400微升	2毫摩爾/升
2	200微升	200微升1號(hào)管	1毫摩爾/升
3	200微升	200微升2號(hào)管	0.5毫摩爾/升
4	200微升	0	0

 

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

 

• 移取900微升稀釋液（Reagent E）到2毫升離心管
• 加入100微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）
• 加入200微升顯色液（Reagent F）
• 渦旋震蕩60秒
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g
• 小心移取1毫升藍(lán)綠色上層液相到新的比色皿
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至7四次
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光讀數(shù)；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)油酸濃度（毫摩爾/升）

 

• 背景對(duì)照測(cè)定

 

• 移取800微升緩沖液（Reagent C）到2毫升離心管
• 加入100微升底物液（Reagent D）
• 加入100微升稀釋液（Reagent E）
• 渦旋震蕩60秒
• 37℃溫度下孵育30分鐘
• 移取100微升到新的2毫升離心管
• 加入1毫升稀釋液（Reagent E）
• 加入200微升顯色液（Reagent F）
• 渦旋震蕩60秒
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g
• 小心移取1毫升上層液相到新的比色皿
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得背景吸光讀數(shù)

六、樣品總活性測(cè)定

 

• 移取800微升緩沖液（Reagent C）到2毫升離心管
• 加入100微升底物液（Reagent D）
• 加入100微升上述制備的待測(cè)樣品（50微克樣品蛋白）
• 渦旋震蕩60秒
• 37℃溫度下孵育30分鐘
• 移取100微升到新的2毫升離心管
• 加入1毫升稀釋液（Reagent E）
• 加入200微升顯色液（Reagent F）
• 渦旋震蕩60秒
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g
• 小心移取1毫升藍(lán)綠色上層液相到新的比色皿
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得樣品吸光讀數(shù)
• 實(shí)際吸光讀數(shù)：樣品吸光讀數(shù)—背景吸光讀數(shù)
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)油酸濃度（毫摩爾/升）

 

• 樣品非特異活性測(cè)定

 

• 移取750微升緩沖液（Reagent C）到2毫升離心管
• 加入100微升底物液（Reagent D）
• 加入50微升專性液（Reagent G）
• 加入100微升上述制備的待測(cè)樣品（50微克樣品蛋白）
• 渦旋震蕩60秒
• 37℃溫度下孵育30分鐘
• 移取100微升到新的2毫升離心管
• 加入1毫升稀釋液（Reagent E）
• 加入200微升顯色液（Reagent F）
• 渦旋震蕩60秒
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g
• 小心移取1毫升藍(lán)綠色上層液相到新的比色皿
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 實(shí)際吸光讀數(shù)：樣品吸光讀數(shù)—背景吸光讀數(shù)
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)油酸濃度（毫摩爾/升）

 

• 計(jì)算樣品活性

 

• 樣品總活性和非特異活性計(jì)算

 

[根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)油酸濃度（毫摩爾/升）X 10（稀釋倍數(shù)）X 1（反應(yīng)體系容量；毫升）]÷[ 0.1（樣品容量；毫升）X 30（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝微摩爾/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝微摩爾/毫克/分鐘

 

 

• 樣品特異活性計(jì)算

 

樣品總活性－樣品非特異活性＝樣品特異活性

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測(cè)定只需1次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 如果底物液（Reagent D）粘稠，加熱孵育后呈現(xiàn)乳白色液體，即可使用
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本讀數(shù)高于背景讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 溶酶體酸性脂酶單位活性定義為：在37℃，pH 5.0條件下，每分鐘內(nèi)能夠釋放1微摩爾游離脂肪酸所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列細(xì)胞脂類酶學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感