動物血小板線粒體可溶性總蛋白制備試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

動物血小板線粒體可溶性總蛋白制備試劑是一種旨在通過低速差速離心和化學(xué)滲壓休克處理純化血小板、以及物理或化學(xué)破膜和高速差速離心的方法，直接從動物血細胞中分離出完整而純化的血小板線粒體細胞器，并在蛋白酶抑制混合劑的幫助下，使已純化的線粒體膜結(jié)構(gòu)破裂而獲得線粒體內(nèi)活性蛋白酶系統(tǒng)的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適合于人體和各種動物全血（鼠、豬、羊等）中血小板線粒體可溶性總蛋白的制備�？梢员挥糜诩毎�凋亡、信號傳遞、代謝和營養(yǎng)學(xué)等的研究�？芍苯佑糜谔囟ǖ鞍缀罄m(xù)純化、蛋白一維或二維電泳、西方雜交、免疫抗體和質(zhì)譜分析等等。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

線粒體是細胞中重要的細胞器，其主要功能是提供細胞內(nèi)各種物質(zhì)代謝所需要的能量。線粒體中含有豐富的細胞色素氧化酶系統(tǒng)和細胞凋亡相關(guān)蛋白等。通過機械或化學(xué)方法破裂細胞，進而差速離心獲得線粒體，然后通過特殊裂解液和蛋白酶抑制混合劑防止裂解后線粒體內(nèi)各種活性蛋白成分遭到活化的內(nèi)源性蛋白酶的破壞，充分保留線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫和生物學(xué)活性，最后進行相關(guān)蛋白的獨立分析。 

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）   500毫升

裂解液（Reagent B）    80毫升

凈化液（Reagent C）    20毫升

強化液（Reagent D）    10毫升

保存液（Reagent E）   200毫升

破膜液（Reagent F）         2毫升

活性液（Reagent G）    20微升

上樣液（Reagent H）     3毫升

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存凈化液（Reagent C）和活性液（Reagent G）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

4℃臺式離心機：用于樣品操作

4℃超速離心機：用于樣品操作

DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞

超聲儀：用于裂解細胞

實驗步驟

• 物理處理法

實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）到4毫升的裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標記為裂解工作液。然后進行下列操作。

• 準備1個無菌的50毫升錐形離心管
• 輕輕混勻10至20毫升新鮮（2小時內(nèi)抽取的靜脈血）的抗凝全血樣品
• 移入到50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細胞顆粒群
• 用手指輕彈離心管2至3下，使細胞顆粒群松動
• 加入10毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放進臺式離心機離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液合并到上述50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細胞顆粒群（扔掉含有細胞顆粒群的離心管）
• 放入含有上清液的離心管到臺式離心機離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細胞顆粒群（扔掉含有細胞顆粒群的離心管）――此步驟獲得血小板富集血清
• 放入含有上清液的離心管到臺式離心機離心20分鐘，速度為2000g
• 可見白色沉淀顆粒群，小心抽掉上清液
• 加入10毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放入臺式離心機離心20分鐘，速度為2000g
• 小心抽去上清液（注意：如果暫時停止操作，須暫時放進－70℃冰箱里）――此步驟獲得純化的血小板
• 加入5毫升預(yù)冷的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
• 即刻放進預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿幫勻化細胞（約10下）（注意：參見注意事項11）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）置于超聲儀槍頭下，離心管在冰槽里
• （選擇步驟）超聲功率為60％（或150赫茲）猝擊10秒，間隙30秒，10個循環(huán)
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除未溶解的細胞
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆�！�—此步驟獲得線粒體沉淀物
• （選擇步驟）加入3毫升預(yù)冷的保存液（Reagent E）
• （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心5分鐘，速度為10000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入100微升破膜液（Reagent F）到線粒體顆粒樣品中
• 加入1微升活性液（Reagent G）
• 渦旋震蕩15秒
• 置入冰槽中孵育15分鐘
• 渦旋震蕩60秒
• 放進微型臺式離心機離心2分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管――此為所有可溶性線粒體蛋白系統(tǒng)
• 若暫時不予后續(xù)處理，保存在－20℃冰箱里
• 繼續(xù)進行下列操作：

操作一、線粒體總蛋白定量檢測

1） 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

操作二、可溶性線粒體蛋白電泳

1） 移取20微升（1微克/微升）上清液到新的1.5毫升離心管

2） 加入20微升上樣液（Reagent H）

3） 渦旋震蕩15秒

• 放進微型臺式離心機離心10秒，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 煮沸5分鐘
• 上樣，進行電泳操作和西方雜交

• 化學(xué)處理法

實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）到4毫升的裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標記為裂解工作液。然后進行下列操作。

• 準備1個無菌的50毫升錐形離心管
• 輕輕混勻10至20毫升新鮮（2小時內(nèi)抽取的靜脈血）的抗凝全血樣品
• 移入到50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細胞顆粒群
• 用手指輕彈離心管2至3下，使細胞顆粒群松動
• 加入10毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放進臺式離心機離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液合并到上述50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細胞顆粒群（扔掉含有細胞顆粒群的離心管）
• （選擇步驟）放入含有上清液的離心管到臺式離心機離心15分鐘，速度為200g
• （選擇步驟）小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細胞顆粒群（扔掉含有細胞顆粒群的離心管）――此步驟獲得血小板富集血清
• 放入含有上清液的離心管到臺式離心機離心20分鐘，速度為2000g
• 可見白色沉淀顆粒群，小心抽掉上清液
• 加入10毫升預(yù)冷的清理液(Reagent A)，混勻細胞顆粒群
• 放入臺式離心機離心20分鐘，速度為2000g
• 小心抽去上清液（注意：如果暫時停止操作，須暫時放進－70℃冰箱里）――此步驟獲得純化的血小板
• 入5毫升預(yù)冷的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入500微升預(yù)冷的強化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項12）
• 加入5毫升預(yù)冷的保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除未溶解的細胞
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆�！�—此步驟獲得線粒體沉淀物
• （選擇步驟）加入3毫升預(yù)冷的保存液（Reagent E）
• （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心5分鐘，速度為10000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入100微升破膜液（Reagent F）到線粒體顆粒樣品中
• 加入1微升活性液（Reagent G）
• 渦旋震蕩15秒
• 置入冰槽中孵育15分鐘
• 渦旋震蕩60秒
• 放進微型臺式離心機離心2分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管――此為所有可溶性線粒體蛋白系統(tǒng)
• 若暫時不予后續(xù)處理，保存在－20℃冰箱里
• 繼續(xù)進行下列操作：

操作一、線粒體總蛋白定量檢測

1． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

操作二、可溶性線粒體蛋白電泳

• 移取20微升（1微克/微升）上清液到新的1.5毫升離心管
• 加入20微升上樣液（Reagent H）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進微型臺式離心機離心10秒，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 煮沸5分鐘
• 上樣，進行電泳操作和西方雜交

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次（10至20毫升全血）操作
• 其它實際操作的全血容量與試劑使用量按比例調(diào)整：例如40毫升全血，試劑用量加倍
• 操作時，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）
• 操作時，須戴手套
• 建議使用新鮮全血：2小時內(nèi)的全血為理想狀態(tài)，不要超過24小時
• 全血樣品采集須使用全血樣品采集須使用EDTA二鉀血液抗凝液（12059.1）、ACD血液抗凝液（12059.4），或肝素鈉血液抗凝液（12059.5）
• 建議使用足夠的樣品量
• 血小板提取量因人而異；如果不足，建議增加全血量
• 線粒體操作均須在4℃或以下狀態(tài)下進行
• 建議嚴格控制操作時間
• 通常勻化次數(shù)為10下（或細胞顆粒群消失為止）達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
• 通常孵育5分鐘達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數(shù)
• 物理處理法是優(yōu)先推薦的技術(shù)處理
• 通常每毫升全血平均可獲得2 X 10⁸血小板
• 通常10毫升全血的血小板線粒體含量為10至25微克線粒體蛋白

如果需檢測不可溶性線粒體蛋白，可保留線粒體裂解后的沉淀物，直接加入10微升上樣液（Reagent H）和10微升無離子水，然后繼續(xù)操作二的步驟3至6

• 本公司提供系列線粒體試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無蛋白酶污染
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定蛋白萃取產(chǎn)量高
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定純化程度高