動物細胞線粒體可溶性總蛋白制備試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

動物細胞線粒體可溶性總蛋白制備試劑是一種旨在從動物細胞中分離出完整而純化的線粒體細胞器，并在蛋白酶抑制混合劑的幫助下，使已純化的線粒體膜結構破裂而獲得線粒體內活性蛋白酶系統(tǒng)的權威而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物細胞（動物和人體的原代細胞、培養(yǎng)細胞等）中線粒體總蛋白的制備�？梢员挥糜诩毎�凋亡、信號傳遞、古生物、衰老、代謝和營養(yǎng)學等的研究。可直接用于特定蛋白后續(xù)純化、蛋白一維或二維電泳、西方雜交、免疫抗體和質譜分析等等。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術背景

線粒體是細胞中重要的細胞器，其主要功能是提供細胞內各種物質代謝所需要的能量。線粒體中含有豐富的細胞色素氧化酶系統(tǒng)和細胞凋亡相關蛋白等。通過機械或化學方法破裂細胞，進而差速離心獲得線粒體，然后通過特殊裂解液和蛋白酶抑制混合劑防止裂解后線粒體內各種活性蛋白成分遭到活化的內源性蛋白酶的破壞，充分保留線粒體內蛋白質的免疫和生物學活性，最后進行相關蛋白的獨立分析。

產品內容

清理液（Reagent A）   100毫升

裂解液（Reagent B）    80毫升

凈化液（Reagent C）    20毫升

強化液（Reagent D）    10毫升

保存液（Reagent E）   160毫升

破膜液（Reagent F）         2毫升

活性液（Reagent G）    20微升

上樣液（Reagent H）     3毫升

產品說明書          1份

保存方式

保存凈化液（Reagent C）和活性液（Reagent G）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

HANK平衡鹽緩沖溶液（12028）或PBS緩沖溶液（12033）：用于清理細胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細胞脫離

完全細胞培養(yǎng)液（12052）：用于細胞處理所需的培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

4℃臺式離心機：用于樣品操作

微型4℃臺式離心機：用于樣品操作

DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞

渦旋震蕩儀：用于混勻

實驗步驟

方法一：物理法

實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。

• 準備5至10瓶75cm²細胞培養(yǎng)瓶的細胞（5 X 10⁷），直至細胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面
• 分別小心抽去緩沖溶液
• 重復實驗步驟2至3一次
• 分別加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
• 放進37℃培養(yǎng)箱3分種
• 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落
• 分別加入10毫升用戶自備的完全細胞培養(yǎng)液
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻細胞
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預冷的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
• 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約80下）（注意：參見注意事項8）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆�！�—此步驟獲得線粒體沉淀物
• （選擇步驟）加入3毫升預冷的保存液（Reagent E）
• （選擇步驟）放進4℃臺式離心機再次離心5分鐘，速度為10000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入100微升破膜液（Reagent F）到線粒體顆粒樣品中
• 加入1微升活性液（Reagent G）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進冰槽中孵育15分鐘
• 渦旋震蕩60秒
• 放進微型臺式離心機離心2分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管――此為所有可溶性線粒體蛋白系統(tǒng)
• 若暫時不予后續(xù)處理，保存在－20℃冰箱里
• 繼續(xù)進行下列操作：

操作一、線粒體總蛋白定量檢測

1） 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）

操作二、可溶性線粒體蛋白電泳

1） 移取20微升（1微克/微升）上清液到新的1.5毫升離心管

2） 加入20微升上樣液（Reagent H）

• 渦旋震蕩15秒
• 放進微型臺式離心機離心10秒，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 煮沸5分鐘
• 上樣，進行電泳操作和西方雜交

方法二：化學法

實驗開始前，將－20℃冰箱里的凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。

• 準備5至10瓶75cm²細胞培養(yǎng)瓶的細胞（5 X 10⁷），直至細胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面
• 分別小心抽去緩沖溶液
• 重復實驗步驟2至3一次
• 分別加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
• 放進37℃培養(yǎng)箱3分種
• 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落
• 分別加入10毫升用戶自備的完全細胞培養(yǎng)液
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預冷的清理液（Reagent A）
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預冷的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入500微升預冷的強化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項9）
• 加入5毫升預冷的保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆�！�—此步驟獲得線粒體沉淀物
• （選擇步驟）加入3毫升預冷的保存液（Reagent E）
• （選擇步驟）放進4℃臺式離心機再次離心5分鐘，速度為10000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入100微升破膜液（Reagent F）到線粒體顆粒樣品中
• 加入1微升活性液（Reagent G）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進冰槽中孵育15分鐘
• 渦旋震蕩60秒
• 放進微型臺式離心機離心2分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管――此為所有可溶性線粒體蛋白系統(tǒng)
• 若暫時不予后續(xù)處理，保存在－20℃冰箱里
• 繼續(xù)進行下列操作：

操作一、線粒體總蛋白定量檢測

1） 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）

操作二、可溶性線粒體蛋白電泳

1） 移取20微升（1微克/微升）上清液到新的1.5毫升離心管

2） 加入20微升上樣液（Reagent H）

3） 渦旋震蕩15秒

4）放進微型臺式離心機離心10秒，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

5）煮沸5分鐘

6）上樣，進行電泳操作和西方雜交

注意事項

• 本產品為20次（5 X 10⁷細胞）操作
• 實際操作的細胞量與試劑用量成比例調整
• 操作時須戴手套
• 整個操作過程須在4℃條件下進行
• 使用時，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）
• 建議使用足夠的樣品量；建議使用5 X 10⁷細胞
• 建議嚴格控制操作時間
• 通常勻化次數(shù)為80下達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)。
• 通常孵育5分鐘達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數(shù)
• 對于難以裂解的細胞，例如HeLa細胞，采用物理勻漿法是優(yōu)先推薦的技術處理
• 通常5 X 10⁷細胞的線粒體含量為50微克線粒體蛋白

12． 本產品所獲得的線粒體純度和產量最為理想。通過調整10000g離心速度到3000至8000g，可以提高粗提的線粒體純化程度，但線粒體產量相應減少

• 如果需檢測不可溶性線粒體蛋白，可保留線粒體裂解后的沉淀物，直接加入10微升上樣液（Reagent H）和10微升無離子水，然后繼續(xù)操作二的步驟3至6
• 線粒體蛋白須放在－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆�，避免反復凍�?
• 本公司提供系列線粒體分析試劑產品

質量標準

• 本產品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產品經(jīng)鑒定無蛋白酶污染
• 本產品經(jīng)鑒定蛋白萃取產量高
• 本產品經(jīng)鑒定純化程度高