5’末端DNA探針同位素（[γ³²P]ATP）激酶標(biāo)記試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

5’末端DNA探針同位素（[γ³²P]ATP）激酶標(biāo)記試劑是一種旨在針對(duì)目標(biāo)片段DNA、寡核苷酸引物、銜接體（LINKER）、線性載體等，使用多聚核苷酸激酶的正向反應(yīng)，進(jìn)行5’末端同位素標(biāo)記處理的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其應(yīng)用于后續(xù)雜交、測(cè)序、電泳標(biāo)記、DNA連接反應(yīng)、DNA修飾檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。適用于各種粘性外凸或凹入、平滑末端等DNA分子的標(biāo)記。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作便捷，反應(yīng)敏感，重復(fù)性好。

技術(shù)背景

源自于大腸桿菌重組的噬菌體T4 pseT基因的T4多聚核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase；T4 PNK）是多聚核苷酸5’羥基激酶，為同源四聯(lián)體，分子量為28.9kD。催化ATP上的γ磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈DNA分子上的羥基基團(tuán)的正向反應(yīng)（forward reaction）。

產(chǎn)品內(nèi)容

緩沖液（Reagent A）   3毫升

反應(yīng)液（Reagent B）       50微升

激酶液（Reagent C）       20微升

濃縮液（Reagent D）   1毫升

助沉液（Reagent E）  20微升

沉淀液（Reagent F）   5毫升

凈化液（Reagent G）  15毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)       1份

保存方式

保存緩沖液（Reagent A）、濃縮液（Reagent D）、沉淀液（Reagent F）和凈化液（Reagent G）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

DNA片段：用于連接和克隆的目標(biāo)DNA分子

[γ³²P]ATP同位素：用于同位素標(biāo)記

1.5毫升離心管：用于樣品反應(yīng)操作和保存的容器

恒溫水槽或培養(yǎng)箱：用于孵育或終止反應(yīng)

震蕩器：用于混勻反應(yīng)物

4℃微型臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀樣品

液體閃爍計(jì)數(shù)器（liquid scintillation counter）：用于同位素活性測(cè)定

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，完成好目標(biāo)DNA分子的去磷酸化和膠純化等操作。并將恒溫水槽打開(kāi)，分別設(shè)置37℃和68℃。同時(shí)將－20℃保存的試劑，置于冰槽里融化.然后進(jìn)行下列操作：

• 目標(biāo)DNA分子標(biāo)記
• 準(zhǔn)備1個(gè)1.5毫升離心管
• 按照下表依次加入反應(yīng)物：

	試劑容量
用戶自備的目標(biāo)DNA分子	2微升（總量0.5微克或50皮摩爾）
緩沖液（Reagent A）	13微升
反應(yīng)液（Reagent B）	2微升
用戶自備的[γ32P]ATP	2微升（150微居里/微升；6000居里/毫摩爾）
激酶液（Reagent C）	1微升
總量	20微升

 

• 渦旋震蕩5秒
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)瞬時(shí)離心5秒
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育45分鐘
• 放進(jìn)68℃恒溫水槽孵育20分鐘
• 置于室溫下，靜置15分鐘

標(biāo)記DNA分子純化

• 加入54微升緩沖液（Reagent A）
• 加入25微升濃縮液（Reagent H）
• 加入1微升助沉液（Reeagent I）
• 加入200微升沉淀液（Reagent J）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩15秒，充分混勻
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標(biāo)記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管，標(biāo)記為S1管（上清液）
• 加入700微升凈化液（Reagent K）
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到上述S1管
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入50微升緩沖液（Reagent A），直至溶解，標(biāo)記為D1管（DNA）
• 放進(jìn)－20℃冰箱里保存或置于冰槽里備用

放射性活性測(cè)定

• 準(zhǔn)備3個(gè)1.5毫升離心管，分別標(biāo)記為：S2、D2和R（同位素母液）管
• 移取1微升上述S1管里的上清液到S2管（此為未整合CPM）
• 移取0.5微升上述D1管里的DNA懸液到D2管（此為整合CPM）
• 移取0.5微升同位素[γ³²P]ATP母液到R管（此為總CPM）
• 即刻放進(jìn)液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定
• 獲得CPM值
• 計(jì)算放射性特異活性（Specific Activity）和標(biāo)記效率（Efficiency of Incorporation）

St＝實(shí)際CPM  X  500（稀釋倍數(shù)）

Dt＝實(shí)際CPM  X  50（稀釋倍數(shù)）

Rt＝實(shí)際CPM  X  2（稀釋倍數(shù)）

標(biāo)記效率％（Efficiency of Incorporation）＝（Dt÷Rt）X100％或【Dt÷（Dt＋St）】X100％

特異活性（Specific Activity）＝Dt÷0.5（微克，DNA量）

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 同位素操作須嚴(yán)格遵守規(guī)章制度
• 建議使用帶濾芯的槍頭進(jìn)行分子操作
• 用戶自備的目標(biāo)DNA分子均須去磷酸化處理，例如小牛小腸堿性磷（calf intestinal alkaline phosphatase；CIAP），而未經(jīng)去磷酸化處理的樣品可以進(jìn)行交互反應(yīng)（exchange reaction），但效率欠佳
• 建議用戶自備的目標(biāo)DNA分子予以膠純化處理
• 用戶自備的目標(biāo)DNA分子避免使用醋酸胺和高濃度NaCl等處理
• 同位素³²P標(biāo)記的γATP，建議使用AMERSHAM（安瑪西亞）公司
• 建議使用新鮮同位素材料
• 建議探針標(biāo)記后即刻使用
• 建議使用螺旋蓋的離心管制備同位素探針
• 標(biāo)記探針可保存在－20℃冰箱里。其半衰期為28天
• 理想標(biāo)記總活性為大于1 X 10⁸ CPM/微克DNA；整合效率為20至60％
• 本公司提供系列同位素處理試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶