細菌ATP/ADP/AMP含量高效液相色譜法（HPLC）定量檢測試劑盒使用說明
細菌ATP/ADP/AMP含量高效液相色譜法（HPLC）定量檢測試劑盒
產品說明書（中文版）
主要用途
細菌ATP/ADP/AMP含量高效液相色譜法（HPLC）定量檢測試劑是一種旨在通過高氯酸酸性處理，堿性中和后，在高效液相色譜儀和紫外光度儀下（254nm波長）檢測分析，分離出ATP、ADP或AMP波峰，以定量測定樣品中腺嘌呤核苷酸含量的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細菌樣品中ATP、ADP、AMP的含量檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。
技術背景
腺嘌呤核苷酸（adenine nucleotides），簡稱腺苷，包括單磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷，是一種單體單位，為核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）的組成成分，并提供化學能量，在能量代謝通路中維護諸如肌肉、胞膜等組織細胞結構的生化和生理功能，調節(jié)細胞糖酵解、三羧酸循環(huán)、電子傳遞系統(tǒng)、氧化磷酸化活動。腺嘌呤核苷酸在細胞中濃度低，且不穩(wěn)定，通常通過其類型不同、濃度差異、分布狀況，來評價細胞的代謝情況和能量狀態(tài)。單磷酸腺苷（Adenosine monophosphate；AMP），又稱為5'-腺嘌呤核苷酸或腺苷酸（5'-adenylic acid），是一種在（脫氧）核糖核酸中發(fā)現的核苷酸。它是一種磷酸及核苷腺苷的酯，并由磷酸基團、戊糖核酸糖及堿基腺嘌呤所組成。分子式為C10H14N5O7P，分子量347。AMP可以通過腺苷酸激酶（adenylate kinase）催化2分子ADP生成，或通過ATP以及ADP水解產生。AMP常以腺苷-3',5'-環(huán)化一磷酸（cAMP）形式存在于細胞中。AMP與ATP之比反映細胞ATP生成狀況以及脂肪酸氧化程度。二磷酸腺苷（adenosine diphosphate；ADP），參與ADP-ATP循環(huán)，提供熱能轉換和動態(tài)平衡。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate；ATP）存在于所有代謝活躍的細胞內，是細胞活力的標志。一旦細胞凋亡或壞死，ATP濃度急遽下降。通過高氯酸酸性處理，排除蛋白質干擾，堿性中和后，在高效液相色譜儀和紫外光度儀下（254nm波長）檢測分析，分離出ATP、ADP、AMP波峰，以定量其含量。
產品內容
酸性液（Reagent A） 5毫升
中和液（Reagent B） 1毫升
流相液A（Reagent C） 500毫升
流相液B（Reagent D） 500毫升
標準液（Reagent E） 500微升
產品說明書 1份
保存方式
保存標準液（Reagent E）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；酸性液（Reagent A）和中和液（Reagent B）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
4℃（微型）臺式離心機：用于樣品操作
高效液相色譜儀（HPLC）：用于定量測定
實驗步驟
樣品準備
- 準備好待測細菌樣品
- 進行細菌計數：在分光光度儀上測定OD600或直接計數
- 轉移到預冷的1.5毫升離心管
- 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒
- 加入200微升預冷的酸性液（Reagent A）
- 渦旋震蕩1分鐘
- 轉移到1.5毫升離心管
- 放進4℃微型臺式離心機再次離心10分鐘，速度為6000g
- 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
- 加入31微升中和液（Reagent B），充分混勻
- 置于冰槽里靜置30分鐘
- 即刻移入上清液到新的1.5毫升離心管（注意：避免移取沉淀顆粒）
- 放進－70℃冰箱里保存或置于冰槽里待測
二、測定準備
- 開啟儀器預熱15分鐘
- 根據下表設置高效液相色譜儀（HPLC）參數
|
參數 |
推薦 |
補充說明 |
|
色譜柱 |
長度：25cm 直徑：4.6mm |
Waters儀器或 Agilent儀器 |
|
固定相 |
ODS |
|
|
流動相 |
流相液A（Reagent C）和流相液B（Reagent D） |
參見運行程序 |
|
流速 |
1.3毫升/分鐘 |
|
|
注射容量 |
50微升 |
10微升至100微升 |
|
檢測 |
紫外 |
|
|
波長 |
254nm |
|
|
柱溫 |
25℃ |
|
|
出峰時間（retention） |
5.6分鐘（ATP）；6.5分鐘（ADP）；10分鐘(AMP) |
參考 |
|
運行時間 |
15分鐘 |
參考 |
- 運行程序
|
運行時段 |
程序 |
時間 |
|
開機后預運行 |
100% 流相液A（Reagent C） |
總10分鐘 |
|
檢測運行時段 |
100% 流相液A（Reagent C） 0%流相液B（Reagent D） |
0至9分鐘 |
|
100% 流相液A（Reagent C）至 75% 流相液A（Reagent C） 0%流相液B（Reagent D）至25%流相液B（Reagent D） |
9至15分鐘 | |
|
關機前運行 |
100% 流相液A（Reagent C） 0%流相液B（Reagent D） |
總10分鐘 |
- 標準樣品配制
- 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
- 分別加入100微升流相液A（Reagent C）到1至5號管
- 移取100微升標準液（Reagent E）到1號管，混勻
- 小心移取100微升1號管稀釋的標準液（Reagent E）到2號管，混勻
- 小心移取100微升2號管稀釋的標準液（Reagent E）到3號管，混勻
- 小心移取100微升3號管稀釋的標準液（Reagent E）到4號管，混勻
- 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表
|
管號 |
流相液A（Reagent C） |
標準液（Reagent E） |
標準ATP/ADP/AMP濃度 |
|
1 |
100微升 |
100微升 |
100微摩爾/升 |
|
2 |
100微升 |
100微升1號管 |
50微摩爾/升 |
|
3 |
100微升 |
100微升2號管 |
25微摩爾/升 |
|
4 |
100微升 |
100微升3號管 |
12.5微摩爾/升 |
|
5 |
100微升 |
0 |
0 |
四、色譜分析
- 將上述配制的標準液（Reagent E）和待測樣品放進冰槽里等待
- 每次（每個樣品）注射50微升
- 按照檢測運行程序每次（每個樣品）運行15分鐘
- 獲得色譜波峰圖：波峰面積（peak area）或峰值，保存記錄
五、計算樣本ATP/ADP/AMP濃度
- 方法一：通過儀器中的軟件進行測算
- 方法二：構建標準曲線：縱座標（Y軸）為波峰面積（peak area）；橫座標（X軸）為標準ATP/ADP/AMP濃度（微摩爾/升），根據標準曲線獲得樣品對應ATP/ADP/AMP濃度（微摩爾/升）
- 方法三：公式計算（選擇單一濃度的標準液）
樣本ATP/ADP/AMP濃度（微摩爾/升）=【樣本波峰面積（peak area）X標準ATP/ADP/AMP濃度】÷對應標準ATP/ADP/AMP濃度的波峰面積
注意事項
- 本產品為25次操作，包括標準液
- 操作時，須戴手套
- 系統(tǒng)操作過程中，標準液測定只需1次
- 試劑具有揮發(fā)性，注意密閉瓶蓋或使用封口膜
- 酸性液（Reagent A）和中和液（Reagent B）具有腐蝕性，注意操作安全
- 建議使用流相液A（Reagent C）作為陰性對照或作為基準線
- 色譜柱的異物殘留、氣泡產生、溫度未達均衡等將導致異常波峰、時間偏移等
- 用戶可以使用已知濃度的標準液（Reagent E）作為內參標準加入到樣品中，然后進行萃取，檢測回收率（recovery）
- 腺嘌呤核苷酸的出峰時間（retention）以用戶操作時，使用的標準液（Reagent E）實際出峰為準
- 用戶可以根據要求，計算實際濃度為：納摩爾/毫升、納摩爾/毫克蛋白等
- 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
- 腺嘌呤核苷酸HPLC的參考圖譜如下：
- 本公司提供系列腺嘌呤核苷酸檢測試劑產品
質量標準
- 本產品經鑒定性能穩(wěn)定
- 本產品經鑒定檢測敏感
