一、操作安全性

 （1）可在生物安全柜、常規(guī)超凈工作臺（不開啟排風(fēng)機）中進(jìn)行慢病毒使用操作；

 （2）操作者須穿著實驗服，戴口罩、一次性手套，謹(jǐn)防毒液直接接觸眼耳鼻口或皮膚傷口；

 （3）操作過程注意避免毒液飛散、滴灑，注意勿被銳利器材、針頭等劃破皮膚；

 （4）不慎直接接觸毒液的操作臺、需回收器材，可通過0.25% SDS、70%乙醇、1%次氯酸鈉等溶液滅活病毒；

 （5）使用過的工作臺面、顯微鏡載物臺等經(jīng)70%乙醇擦拭；

 （6）培養(yǎng)器皿、槍頭等廢棄物應(yīng)84消毒液(1:9稀釋)浸泡，或121℃高溫消毒，方可丟棄。

二、慢病毒的保存

（1）慢病毒載體經(jīng)過干冰運輸，在-80℃可保存6個月，保存超過6個月時需重新摸索工作滴度。

（2）凍存的毒液在使用前置于冰上或4℃融化，最好于當(dāng)天用完，未用完的毒液可暫時保存于4℃，不超過2天。

（3）反復(fù)凍融會嚴(yán)重降低慢病毒滴度，每次凍融可降低20%以上，建議在初次使用時按用量進(jìn)一步小量分裝凍存。

慢病毒包裝

三、慢病毒包裝常見問題及預(yù)防

1、不宜使用polybrene的常見細(xì)胞系

Polybrene可以通過中和細(xì)胞表面糖蛋白唾液酸殘基所帶電荷起到增加慢病毒感染效率的作用。但對一些細(xì)胞具有明顯細(xì)胞毒性，若使用反而影響實驗效果。這些細(xì)胞有例如：HSC-T6（大鼠肝星型細(xì)胞），Raw264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞），MCF-7（人乳腺癌細(xì)胞），H929（人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞），GBC-SD（人膽囊癌細(xì)胞株），NB4（人白血病細(xì)胞株），kasumi（人白血病細(xì)胞株），Jurkat（人白血病細(xì)胞株），等。建議在開始實驗前查閱相應(yīng)文獻(xiàn)報道，以及參考的polybrene工作濃度。

2、過表達(dá)不成功的可能原因

（1）質(zhì)粒構(gòu)建有一定的問題。

（2）由于序列具有特殊結(jié)構(gòu)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄困難、mRNA十分不穩(wěn)定等情況下，可導(dǎo)致mRNA水平無法顯著過表達(dá)。在排除質(zhì)粒構(gòu)建問題之后，先通過q-PCR驗證目的基因在mRNA水平的過表達(dá)，可以同時使用293T等易表達(dá)細(xì)胞作為對照。

（3）如果mRNA水平能夠過表達(dá)，可能由于存在翻譯后修飾、密碼子構(gòu)成、翻譯效率、蛋白快速降解等因素，導(dǎo)致蛋白水平過表達(dá)不顯著。同時，使用WB進(jìn)行蛋白水平分析時，需要設(shè)置陽性對照，對實驗條件，尤其是抗體進(jìn)行驗證。

3、如何提高病毒感染效率

 除了提高M(jìn)OI以外，還可以從其他角度嘗試改善感染效率。

（1）適當(dāng)減小孵育培養(yǎng)基體積（加入病毒量不變），可增大病毒密度，有利于提高感染效率。減小體積孵育時需考慮對細(xì)胞狀態(tài)、換液時間的影響。例如，96孔板（50ul），24孔板（250ul），6孔板（1ml），小體積孵育4h，然后補液至正常培養(yǎng)體積，繼續(xù)培養(yǎng)24h后換液。

（2）適當(dāng)延長孵育時間。如延至24 h再換液，注意需要兼顧細(xì)胞狀態(tài)，主要適用于原孵育時間較短（如4-6 h）時。因為慢病毒在37℃半衰期約8小時，所以一味延長孵育時間效用并不明顯。

（3）Polybrene對于很多細(xì)胞可提高感染效率，但同時也存在細(xì)胞毒性，對部分類別細(xì)胞（如神經(jīng)元、DC細(xì)胞）毒性較大而不宜使用。當(dāng)MOI低于20時，也沒有添加Polybrene的必要。具體細(xì)胞的Polybrene使用濃度可參考文獻(xiàn)報道，以及通過預(yù)實驗確定。通常在4-10 ug/ml范圍。Protamine sulfate作為Polybrene替代物對部分細(xì)胞毒性較小。

（4）如果有可離心孔板的平角離心轉(zhuǎn)頭，可以2200rpm邊離心邊感染2 h（37℃），然后繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中按標(biāo)準(zhǔn)條件孵育培養(yǎng)。該方式對于懸浮細(xì)胞的感染尤為有益。

（5）如果細(xì)胞狀態(tài)允許，可進(jìn)行重復(fù)感染。孵育結(jié)束后更換不含病毒的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)16-24 h后，重復(fù)感染過程1-2次，可提高感染效率。

四、 “病毒包裝+蛋白質(zhì)組”專屬方案

方案一：根據(jù)興趣因子尋找下游作用因子

病毒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞后，將要研究的基因過表達(dá)或者敲低，通過SILAC和iTRAQ技術(shù)，我們可以找到相關(guān)通路差異表達(dá)蛋白，再進(jìn)行相關(guān)通路特定蛋白的驗證，輕松幫您找到您研究的因子的相關(guān)通路關(guān)鍵效應(yīng)因子。

方案二：根據(jù)特定條件尋找特定作用因子

通過SILAC和iTRAQ技術(shù)，我們可以篩選特定條件（藥物、刺激因子等）下細(xì)胞（標(biāo)本）蛋白水平的變化，根據(jù)研究課題的方向，找到相關(guān)的通路的差異蛋白。再進(jìn)行特異基因在細(xì)胞水平或者在體水平的干擾或者過表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞功能或者在體驗證。