應(yīng)用筆記

Omni國(guó)際土壤DNA試劑盒優(yōu)于公司M土壤DNA分離試劑盒，用于從土壤樣品中提取DNA

Omni國(guó)際有限公司Shari Garrett

介紹

土壤DNA的分子分析是檢測(cè)土壤微生物和微生物多樣性的直接解決方案。從土壤中分離DNA通常是具有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)樵S多污染物（如腐殖酸）的存在可能會(huì)干擾萃取過(guò)程，并且對(duì)多種下游應(yīng)用具有抑制作用。理想的DNA提取方法應(yīng)該有效地消除抑制物質(zhì)并最大化DNA產(chǎn)量。本研究的主要目的是在DNA產(chǎn)量和質(zhì)量方面比較Omni International的土壤DNA試劑盒（26-013G / B）與公司M的土壤DNA分離試劑盒的性能，以及放大潛力和檢測(cè)靈敏度使用實(shí)時(shí)PCR。

材料和方法

設(shè)備

•珠子Ruptor Elite（Cat＃19-040E）

•Bead Ruptor 2 ml管支架套件（Cat＃19-010-310）

•土壤DNA試劑盒（Cat＃26-103G）

珠子Ruptor精英

＃19-040E

使用Omni國(guó)際土壤DNA試劑盒和DNA分離試劑盒（公司M）從200mg摻有10μLZymoBIOMICS TM微生物群落標(biāo)準(zhǔn)（Zymo Research）的室外土壤中分離總DNA。 ZymoBIOMICS™微生物群落標(biāo)準(zhǔn)包含10個(gè)微生物菌株 - 3個(gè)容易裂解的革蘭氏陰性細(xì)菌，5個(gè)易裂解革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和2個(gè)難溶性酵母菌，并作為基因的性能比較兩個(gè)套件使用Omni Bead Ruptor Elite將土壤樣品均質(zhì)化，并按照制造商對(duì)每個(gè)試劑盒的推薦方案一式三份進(jìn)行分離。協(xié)議時(shí)間分別為M公司和Omni International提取的約60分鐘和70分鐘，易用性相當(dāng)。

純化的DNA在每個(gè)試劑盒的洗脫緩沖液100μL中洗脫，并使用Promega QuantiFluor dsDNA系統(tǒng)進(jìn)行定量。通過(guò)使用純化DNA的10X，100X和1000X稀釋的16S細(xì)菌特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR來(lái)分析來(lái)自兩個(gè)試劑盒的純化DNA的質(zhì)量。使用利斯特氏菌特異性引物或酵母屬特異性引物，在10X和100X稀釋度下進(jìn)一步測(cè)試2種耐力裂解單核細(xì)胞增生利斯特氏菌（Gram陽(yáng)性細(xì)菌）和釀酒酵母（酵母）的相對(duì)豐度。簡(jiǎn)而言之，使用安捷倫的Brilliant III 2XSYBR®作為主混合物將qPCR反應(yīng)設(shè)置為總體積為20μL，并在合適的稀釋液下按照ABI 7900上的標(biāo)準(zhǔn)方案，用合適的引物擴(kuò)增2μL模板DNA。

產(chǎn)量（μg）

10

8

6

4

2

0

土壤DNA試劑盒（Cat＃26-103G）

圖1.兩者的平均DNA產(chǎn)量

該套件使用Omni Bead Ruptor Elite as

Omni國(guó)際公司M均化器。 （* p <0.05）

28

27

26

25

Ct 24

平均23

22

21

20

19

18

10X 100X 10X 100X

單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌釀酒酵母（Saccharomyces cerevisae）

Omni國(guó)際 公司M

圖2.通過(guò)用李斯特菌和酵母特異性引物擴(kuò)增來(lái)自O(shè)mega Bio-tek和Company M試劑盒的純化DNA得到的平均Ct值。

使用Omni國(guó)際試劑盒和公司M試劑盒，摻入ZymoBIOMICS™的土壤樣品的DNA產(chǎn)量如圖1所示。與公司M相比，Omi International試劑盒的性能顯著好于洗脫時(shí)產(chǎn)率提高40％在100μL終體積（8.1μgvs. 5.7μg）（p <0.05; Tukey的事后分析）。基于從qPCR反應(yīng)產(chǎn)生的Ct值來(lái)確定從每次提取獲得的DNA的質(zhì)量。表1顯示了使用16S細(xì)菌特異性引物的純化DNA的連續(xù)稀釋獲得的平均Ct值。 Cts似乎略低于（〜0.5），全方位提取。

表1.使用Omni International和Company M試劑盒和16S細(xì)菌特異性引物，純化DNA的10X，100X，1000X稀釋度的平均Ct值。

Ct

10X 100X 1000X

Omni International 14.93 17.42 21.46

公司M 15.34 18.22 21.97

圖2顯示了使用10X和100X稀釋純化DNA作為模板的利斯特氏菌和酵母特異性引物獲得的平均Ct值。生物體（利斯特氏菌（Listeria monocytogenes）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisae））都是難以理解的，結(jié)果表明，Omni International試劑盒的Ct顯著低于M公司（p <0.05; Tukey的事后分析）。對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌，李斯特菌，Ct降低1個(gè)循環(huán)，酵母菌株Saccharomyces降低近3個(gè)周期;也就是說(shuō)，與M公司相比，使用Omni International試劑盒的利斯特氏菌和酵母菌的產(chǎn)量是兩倍和八倍。連續(xù)稀釋度之間的ΔCt對(duì)于兩種試劑盒（對(duì)于利斯特氏菌為〜3.1，對(duì)于酵母菌為〜3.4）是相當(dāng)?shù)摹Ｔ摂?shù)據(jù)表明，Omni International的試劑盒以及公司M試劑盒在隔離中消除PCR抑制劑但具有優(yōu)異的產(chǎn)量。在qPCR上獲得的Ct值證實(shí)了所獲得的產(chǎn)量，Omni International Soil DNA Kit在兩個(gè)方面均表現(xiàn)優(yōu)異。
結(jié)論

Omni國(guó)際試劑盒分離DNA，產(chǎn)量明顯高于對(duì)試樣土壤樣品的公司M試劑盒，能夠更好地分離韌性裂解生物體。 Omni國(guó)際試劑盒有效地去除了PCR抑制劑，其例子是全分離的DNA比其較低Ct值表示的公司M分離的DNA更早地?cái)U(kuò)增。較低的Ct值也可能表明使用Omni International試劑盒獲得的洗脫DNA的質(zhì)量較高�？傮w而言，結(jié)果表明，Omni國(guó)際土壤DNA試劑盒分離出高產(chǎn)量，高質(zhì)量的DNA，與各種下游應(yīng)用（如qPCR，下一代測(cè)序）兼容。