銳博生物：受PDCD4調(diào)節(jié)的miR-374a-CCND1-pPI3K/AKT-c-JUN反饋環(huán)抑制鼻咽癌細胞生長與代謝
銳博生物 Oncogene：miR-374a反饋環(huán)抑制鼻咽癌
方唯意教授研究團隊近日又在Oncogene上發(fā)文證實了受PDCD4調(diào)節(jié)的miR-374a-CCND1-pPI3K/AKT-c-JUN反饋環(huán)能抑制鼻咽癌細胞生長與代謝。讓我們看看這次的研究思路與結(jié)果吧。
實驗思路與方法
miR-374a對NPC細胞的抑制作用
圖1
與陰性對照組相比，miR-374a mimic抑制細胞生長（圖1a），阻礙G1/S細胞周期過渡（圖1b），還會減少細胞代謝與入侵，此外，miR-374a過表達能增強NPC細胞對DDP的化學(xué)敏感性。反之，用抑制劑敲除miR-374a后顯著恢復(fù)。但是，經(jīng)FACS分析檢測，miR-374a不誘導(dǎo)細胞凋亡。隨后在通過小鼠體內(nèi)實驗驗證了上述結(jié)論（圖1c）。
miR-374a與細胞信號
研究者通過實驗觀察到miR-374a不僅抑制pPI3K（Tyr458），pAKT（Ser473）和c-JUN表達，而且顯著減少細胞周期相關(guān)基因的表達，如CCND1，c-MYC.同時，包括Snail與N-cadherin在內(nèi)的間葉細胞相關(guān)基因表達也下降了，而上皮標(biāo)記物E-cadherin的表達量則出現(xiàn)了增幅，但是細胞凋亡相關(guān)蛋白PDCD4并不受miR-374a的異常表達影響。概括來說，這些數(shù)據(jù)表明miR-374a抑制PI3K/AKT,細胞信號與EMT（Epithelial-MesenchymalTransition），但不調(diào)節(jié)NPC的細胞凋亡。
CCND1的身份與作用
通過miRwalk與RNAhybrid演算法，預(yù)測CCND1與c-MYC是miR-374a的直接靶標(biāo)。用熒光素酶報告基因?qū)嶒炁c共轉(zhuǎn)染實驗證明在NPC細胞中，CCND1,而不是c-MYC，是miR-374a的靶標(biāo)；它還能顯著減少miR-374a的表達，還增強了細胞生長，代謝與侵襲性，降低了細胞對DDP的敏感性。隨后，研究者發(fā)現(xiàn)在CCND1被敲除后，會出現(xiàn)與miR-374a過度表達后觀察到的現(xiàn)象。此外，在NPC細胞中，siRNA對c-MYC的抑制降低了pPI3K與pAKT的表達量，而CCND1的抑制誘導(dǎo)了miR-374a的表達。這表明CCND1通過c-MYC激活PI3K/AKT通道，但其發(fā)生機理不明確。
c-JUN：關(guān)鍵第四號
圖3
研究者通過生物信息學(xué)推測PI3K/AKT途徑通過調(diào)控c-JUN降低miR-374a表達。實驗表明，減弱PI3K的磷酸化作用可減少了pAKT與c-JUN的表達（圖3a）同時刺激了miR-374a的表達（圖3b），而敲除c-JUN（圖3c）誘導(dǎo)miR-374a的表達（圖3d），這表明c-JUN是miR-374a的上游調(diào)控者。隨后我們使用染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)合qPCR分析法發(fā)現(xiàn)c-JUN上調(diào)會使野生型miR-374a啟動子熒光素酶活性降低，且在NPC細胞中c-JUN的抑制降低了CCND1的表達（圖3c）。
PDCD4如何抑制 NPC 細胞活動？
研究者通過實驗證明了在5-8F細胞中PDCD4過表達顯著降低細胞遷移與侵襲性，同時降低EMT-相關(guān)基因的表達，而在PDCD4正常表達的SUNE1與HONE1細胞中觀察到相反的結(jié)果。這表明PDCD4通過EMT信號抑制細胞代謝與入侵。
miR-374a：我要插腳PDCD4調(diào)節(jié)
在此研究中，他們發(fā)現(xiàn)并證實在shPDCD4 NPC細胞中miR-374a顯著下調(diào)，且在PDCD4過表達時出現(xiàn)相反的影響，而c-JUN直接抑制miR-374a表達。此外還發(fā)現(xiàn)在PDCD4過表達的5-8F NPC細胞中，結(jié)合到miR-374a啟動子上的c-JUN會顯著減少。抑制miR-374a可部分恢復(fù)CCND1與pPI3K水平，同時總PI3K或PDCD4在c-JUN敲除后未出現(xiàn)改變。這些數(shù)據(jù)表明PDCD4通過PI3K/AKT/c-JUN途徑誘導(dǎo)miR-374a表達。
捋捋三角關(guān)系
圖4
接著，他們嘗試著理清miR-374a, PDCD4與CCND1之間mRNA水平的關(guān)系。相比起正常鼻咽（NP）組織，NPC樣本中的miR-374a（圖4a，1）與PDCD4（圖4a，3）的表達水平下降，而在癌癥組織中CCND1顯著下降（圖4a，2）。這說明miR-374a表達與CCND1表達成負相關(guān)（圖4b，1）且與PDCD4表達成正相關(guān)（圖4b，2）。此外，經(jīng)統(tǒng)計分析表明，CCND1表達與PDCD4表達呈負相關(guān)（圖4b，3）。他們還做了存活分析，得出高CCND1、低PDCD4表達的患者預(yù)后性更差，反之，低CCND1、高PDCD4表達的患者存活時間更長（圖4c）。
這篇文章的總體實驗思路與之前的那篇文章的基本相同，綜合兩篇文章來看，我們不難發(fā)現(xiàn)miRNA在癌變過程中作為致癌基因或腫瘤抑制劑，扮演了一個舉足輕重的角色。因此，了解每一個miRNA的功能及其表達圖譜將會幫助我們驗證它們作為診斷標(biāo)志的作用并提供癌癥治療的治療靶標(biāo)。miR-374a最初是作為某些腫瘤的致癌基因被報道的，但在此文章以及其他文章報道中則有相反的結(jié)果，這說明miRNA的分子功能與基礎(chǔ)都是極其復(fù)雜與矛盾的，不能一概而論，同時鼓勵我們進行更多的研究來探索每個miRNA在特定環(huán)境中的作用。
原文：miR-374a-CCND1-pPI3K/AKT-c-JUN feedback loop modulated by PDCD4 suppresses cell growth, metastasis, and sensitizes nasopharyngeal carcinoma to cisplatin
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