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TSQ Endura LC-MS/MS與TraceFinder軟件用于440種農(nóng)殘同時(shí)定量的高通量分析

瀏覽次數(shù)：3568　發(fā)布日期：2017-2-15　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

一站式流程化農(nóng)殘檢測(cè)解決方案：TSQ Endura LC-MS/MS 與 TraceFinder 軟件用于蔬菜基質(zhì) 中 440 種農(nóng)殘同時(shí)定量的高通量分析

1.前言

近些年來(lái)，此起彼伏的食品安全事件引起了人們強(qiáng)烈的關(guān)注，持續(xù)不斷地嚴(yán)格加強(qiáng)食品安全監(jiān)管已經(jīng)成為全社會(huì)最大的共識(shí)，這直接刺激了限量標(biāo)準(zhǔn)更嚴(yán)格、體系架構(gòu)更嚴(yán)謹(jǐn)完備的食品安全標(biāo)準(zhǔn)的誕生與升級(jí)。在中國(guó)，新版GB2763-2014《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)已正式頒布實(shí)施，它連同日本的肯定列表制度（positive list system）、歐盟的EU/EC 指令條例No.752/2014 等一道，共同構(gòu)成了各國(guó)嚴(yán)格的食品安全監(jiān)管法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)體系。相較于上一版，新國(guó)標(biāo)2763-2014 收錄的農(nóng)殘種類(lèi)與最大殘留量指標(biāo)（MRLs）都有了較大的擴(kuò)容增項(xiàng)，這無(wú)疑對(duì)相應(yīng)的農(nóng)殘檢測(cè)手段提出了更高更嚴(yán)格的技術(shù)要求。時(shí)至今日，食品安全領(lǐng)域中的工作常態(tài)已然轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)復(fù)雜基質(zhì)中數(shù)百計(jì)的多農(nóng)殘項(xiàng)目同時(shí)進(jìn)行高靈敏度、高特異性的高通量檢測(cè)，這種業(yè)態(tài)轉(zhuǎn)變需要質(zhì)譜技術(shù)的革新，也需要測(cè)試解決方案的完善。

TSQ Endura LC-MS/MS是基于主動(dòng)離子管控技術(shù)（Active Ion Management，AIMTM）開(kāi)發(fā)的全新一代液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，它通過(guò)S-lens射頻透鏡組、中性粒子擋桿、HyperQuad四極桿、主動(dòng)離子碰撞池、雙模式離散打拿極檢測(cè)器等集成創(chuàng)新（圖1），使得儀器對(duì)離子聚焦、傳輸、隔離、碰撞與檢測(cè)等離子操控環(huán)節(jié)得以實(shí)現(xiàn)了全新突破，賦予了其領(lǐng)先的靈敏度、高達(dá) 500 SRM/s 的掃描速度與出色的穩(wěn)健性，從而能全面滿(mǎn)足復(fù)雜基質(zhì)中多農(nóng)殘高通量檢測(cè)的各種技術(shù)挑戰(zhàn)，在食品安全領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用空間與使用價(jià)值。

本文展示了一種以 TSQ Endura MS 為平臺(tái)、以 TraceFinderTM軟件為流程化驅(qū)動(dòng)引擎的一站式農(nóng)殘檢測(cè)解決方案，并將其用于菜椒基質(zhì)中 440 種農(nóng)殘同時(shí)定量的高通量檢測(cè)分析。

圖 1. 創(chuàng)新的 TSQ Endura MS 質(zhì)譜儀硬件構(gòu)造示意圖

1.實(shí)驗(yàn)條件

2.1 樣品制備

實(shí)驗(yàn)使用的農(nóng)殘標(biāo)樣由Ultra Scientific 公司提供（Rhode Island, USA），440 種農(nóng)殘混標(biāo)乙腈溶液的母液濃度為 2.5 µg/ mL。

菜椒（bell pepper）空白基質(zhì)由美國(guó)California Department of Food and Agriculture 提供，基質(zhì)由15 g 菜椒勻漿物使用15 mL 乙腈，經(jīng)QuEChERS 方法提取獲得。配置基質(zhì)加標(biāo)樣時(shí),先取適量基質(zhì)加入1.5 倍體積超純水用以改善溶劑效應(yīng)。再取農(nóng)殘混標(biāo)，使用乙腈/ 水（v/v, 4/6）逐級(jí)稀釋?zhuān)詈髮⒓铀蟮目瞻谆|(zhì)與對(duì)應(yīng)濃度點(diǎn)的標(biāo)樣溶液混合，充分渦旋混勻后，得濃度為0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5… ~200 pg/µL（ppb）的一系列溶液。由低至高，每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)進(jìn)樣三針，用以測(cè)試農(nóng)殘?jiān)诓私坊|(zhì)中的最低檢測(cè)限（LOD）與定量限（LOQ），每個(gè)農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在LOQ 到 200 pg/µL濃度區(qū)間內(nèi)繪制。

2.2 色譜分離

反相色譜分離使用Thermo Dionex Ultimate 3000 超高效液相色譜儀完成，配備HPG3400-RS 二元高壓梯度泵（35 µL 小體積靜態(tài)混合器）、WPS-3000TRS 自動(dòng)進(jìn)樣器與 TCC-3000RS柱溫箱,色譜條件見(jiàn)下表。

2.3 質(zhì)譜檢測(cè)

質(zhì)譜檢測(cè)使用TSQ Endura MS 串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀的 tSRM 定時(shí)選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)功能（timed Selected Reaction Monitor）進(jìn)行，配備Easy-Max NGTM HESI 加熱電噴霧離子源。包括保留時(shí)間、SRM 離子對(duì)、RF 電壓與碰撞能量等在內(nèi)的 tSRM條件，直接從TraceFinder軟件pQuan化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（version 1.0, pesticides Quantitation chemical database）調(diào)用（圖 2）， TSQ Endura MS 儀器方法編輯為拖拽- 釋放式設(shè)計(jì)，且支持各種方法模板的靈活定制（圖 3）。根據(jù)農(nóng)殘不同的電離屬性，方法中正負(fù)電離模式來(lái)回切換。依據(jù)不同化學(xué)屬性的農(nóng)藥因色譜行為而造成的峰寬不同，設(shè)定 tSRM 時(shí)間窗口為 1~5 min。除十三嗎啉、丙環(huán)唑等少數(shù)物質(zhì)外，其余絕大多數(shù)設(shè)定為 1 min。Q1 與 Q3 分辨率設(shè)定為0.7 FWHM，Q2 碰撞池氬氣壓力為 1.5 mTorr。tSRM 掃描循環(huán)時(shí)間（cycle time）為 1.2 s。其余質(zhì)譜條件見(jiàn)下表。

圖 2 農(nóng)殘檢測(cè)方法 TraceFinder pQuan 化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)

圖 3 實(shí)驗(yàn)使用的質(zhì)譜 tSRM 儀器方法模板界面

2.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)使用TraceFinder 3.2 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)管理、序列采集、數(shù)據(jù)處理以及報(bào)告模板自定義與輸出，其靈活強(qiáng)大的功能可為農(nóng)殘檢測(cè)的流程化提供一站式服務(wù)。尤其，作為面向食品安全常見(jiàn)農(nóng)殘的檢測(cè)方法數(shù)據(jù)庫(kù)，TraceFinder 中 pQuan 數(shù)據(jù) 庫(kù)包含了完備的農(nóng)殘定量與確證信息，以及保留時(shí)間、CAS、基本用途等其他相關(guān)信息（圖2）。利用pQuan 數(shù)據(jù)庫(kù)，實(shí)驗(yàn)無(wú)需再使用標(biāo)樣進(jìn)行繁瑣的方法優(yōu)化與開(kāi)發(fā)，而是從數(shù)據(jù)庫(kù) 中調(diào)取相關(guān)的條件，直接進(jìn)行樣品測(cè)定。如圖 4 展示的步驟， TraceFinder 軟件使得同時(shí)進(jìn)行數(shù)百種農(nóng)殘檢測(cè)的繁復(fù)工作大大清晰地流程化了。

圖 4 TraceFinder 軟件用于農(nóng)殘檢測(cè)的流程化工作步驟

3. 結(jié)果與討論 TSQ Endura MS 具有業(yè)界領(lǐng)先的 SRM 掃描速度，使用簡(jiǎn) 便的 tSRM 功能，質(zhì)譜只在給定的時(shí)間窗口內(nèi)進(jìn)行特定離子對(duì) 的掃描。一方面，這大大提高了質(zhì)譜掃描離子駐留時(shí)間（dwell time）的利用率；另一方面，也唯有此才使得在短至20 min的快速梯度內(nèi)同時(shí)對(duì)數(shù)百余種農(nóng)殘進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)成為可能（圖 5）。通過(guò)對(duì)色譜條件的系統(tǒng)優(yōu)化，從圖 6 散點(diǎn)圖與頻次圖可知，實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了對(duì)440 種農(nóng)殘良好的色譜分離，它們均勻地分布在 20 min 有效分離時(shí)間窗口內(nèi)，這確保了質(zhì)譜 tSRM 掃描循環(huán)時(shí)間可以較為均衡地分配到每個(gè)transition 上，改善定量效果。

圖 5 上圖：菜椒基質(zhì)中 440 種農(nóng)殘同時(shí)檢測(cè)的總離子流圖，下圖：440 種農(nóng)殘的提取離子色譜圖（10 pg/µL）

圖 6（1）農(nóng)殘精確m/z vs. 保留時(shí)間散點(diǎn)圖，（2）保留時(shí)間的頻次分布圖

TraceFinder 具有豐富強(qiáng)大的數(shù)據(jù)瀏覽、編輯與再處理等功能，能為高通量農(nóng)殘檢測(cè)數(shù)據(jù)處理提供全方位的功能支持。圖 7 為 TraceFinder 數(shù)據(jù)結(jié)果的一種典型界面，這中間 LC-MS/MS 農(nóng)殘分析的各種信息得以高度凝練地圖形化展示，統(tǒng)全局于一眼，大大有助于提高實(shí)際檢測(cè)工作中的信息處理效率。同時(shí)，這一界面可模板化編輯，具有出色的可擴(kuò)展性，能滿(mǎn)足不同實(shí)驗(yàn)室的個(gè)性化需求。

圖 7 TraceFinder 農(nóng)殘檢測(cè)數(shù)據(jù)處理結(jié)果的典型界面（Compound View）

實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格綜合考慮峰面積的變異系數(shù) CV % （LOD 濃度點(diǎn)處三次重復(fù)進(jìn)樣的 CV% 開(kāi)始穩(wěn)定重現(xiàn)地小于 30%，LOQ 濃度點(diǎn)處小于 20%）、色譜峰形與信噪比等三種因素，確定了 TSQ Endura MS 對(duì)菜椒基質(zhì)中 440 種農(nóng)殘進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)的 LOD 與 LOQ 值，結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)農(nóng)藥化學(xué)屬性導(dǎo)致的響應(yīng)水平不同，LOD在0.005 pg/µL（5 ppt）到 20 pg/µL（20 ppb）之間，LOQ分布在0.01 pg/µL（10 ppt）到 50 pg/µL（50 ppb）范圍內(nèi)，對(duì)應(yīng)的峰面積 CV% 分別為 0.34~29.95% 與 0.43~19.94%。并且，有 430 種農(nóng) 殘的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)大于 0.99，顯示 TSQ Endura MS 具有出色的線(xiàn)性。

進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析得知，實(shí)驗(yàn)中 440 種農(nóng)殘 LOD 與 LOQ 的中位數(shù)值（median value）分別為0.05 pg/µL（50 ppt）與 0.1 pg/µL（100 ppt），顯示了基于主動(dòng)離子管控技術(shù)研發(fā)的 TSQ Endura MS 具有出色的靈敏度性能。同時(shí)，值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)為確保分析的高通量性與大多數(shù)農(nóng)殘的檢測(cè)效果，使用了單一流動(dòng)相體系進(jìn)行快速正負(fù)電離切換，一定程度上犧牲了適用于負(fù)離子模式的農(nóng)殘的檢測(cè)靈敏度（使用乙酸銨體系，會(huì)有很大改善）。但盡管如此，如圖 8 所示，對(duì)表 1 中的農(nóng)殘 LOD 與 LOQ 值進(jìn)行頻次分析可知，累計(jì)分別有438（占總數(shù) 的 99.5%）與 430 種（占總數(shù)的 97.7%）農(nóng)殘的 LOD 與 LOQ 小于 10 pg/µL 這一國(guó)標(biāo)最低 MRL 限值，同時(shí)這也是歐盟法規(guī) 與日本肯定列表制度中的通用標(biāo)準(zhǔn)。本方法實(shí)現(xiàn)的 LOQ 全部滿(mǎn)足GB2763-2014強(qiáng)制國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的MRLs指標(biāo)要求。因此， TSQ Endura LC-MS/MS 是食品安全領(lǐng)域中高靈敏度、高特異性與高通量農(nóng)殘檢測(cè)的優(yōu)質(zhì)平臺(tái)。

圖 8 本實(shí)驗(yàn)中440 種農(nóng)殘同時(shí)檢測(cè)的LOD與LOQ值頻次統(tǒng)計(jì)結(jié)果

4. 結(jié)論：

• 利用主動(dòng)離子管控技術(shù)的創(chuàng)新設(shè)計(jì)，TSQ Endura MS 實(shí)現(xiàn)了出色靈敏度、極致耐用性與高度易用性的有機(jī)統(tǒng)一。

• TraceFinder 強(qiáng)大靈活的數(shù)據(jù)處理功能、智能交互式信息管理界面，以及pQuan 農(nóng)殘檢測(cè)方法數(shù)據(jù)庫(kù)，能夠?yàn)檗r(nóng)殘檢測(cè)提供一站式的全流程服務(wù)。

• TSQ Endura LC-MS/MS 與 TraceFinder 軟件強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，將在農(nóng)殘檢測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用空間。

5. 致謝

作者們對(duì)賽默飛世爾科技美國(guó)圣何塞工廠的Dr. Jia Wang 與 Dr. Dipankar Ghosh 表示最誠(chéng)摯的感謝，感謝他們?cè)跇?biāo)樣采購(gòu) 與實(shí)驗(yàn)組織過(guò)程中提供的無(wú)私幫助。感謝 CDFA 饋贈(zèng)給我們多種蔬菜與水果空白基質(zhì)。

表 1 菜椒基質(zhì)中 440 種農(nóng)藥的定量結(jié)果