SWATH（Sequential Window Acquisition of all THeoretical Mass Spectra）采集模式是蘇黎世聯(lián)邦理工學院及AB SCIEX（全球領先的生命科學分析技術公司）的科學家聯(lián)合推出的一項基于質(zhì)譜應用的新技術。利用此項技術，科學家有史以來首次可以獲得單獨蛋白質(zhì)組學樣品分析中每個肽段的數(shù)據(jù)。

Q: SWATH技術的原理是什么？

A: SWATH是MS/MSALL技術的擴展，其采集模式是一種新型的MS/MS掃描技術，將掃描范圍劃分為以25Dalton為間隔的一系列區(qū)間，通過超高速掃描來獲得掃描范圍內(nèi)全部離子的所有碎片信息。

Q: SWATH技術有哪些特點？

A：靈敏度高——SWATH技術繼承了MRM的數(shù)據(jù)采集模式，結合高分辨率的Triple-TOF 5600 plus質(zhì)譜系統(tǒng)，具有與MRM相當?shù)撵`敏度；

可重現(xiàn)性高——重復樣品間的定量相關性可達到0.99以上；

定量準確度高——定量準確度幾乎與MRM技術相當；

線性動態(tài)范圍廣——定量范圍可跨越4個數(shù)量級；

Q: SWATH技術可以應用于哪些方面？

A: SWATH技術可以用于蛋白質(zhì)組定量、蛋白復合體的鑒定和宿主蛋白（HCPs）分析。

蛋白質(zhì)組定量——對細胞、組織或器官中含有的不同時期、不同條件下蛋白表達水平的研究，生物標志物的尋找都需要對蛋白質(zhì)進行鑒定和定量。SWATH定量方法基于提取Transition峰面積計算出肽段含量，通過肽段含量推理出蛋白質(zhì)含量的方法。SWATH定量應用到proteome-wide水平就產(chǎn)生了SWATH定量蛋白組，以此方法為基礎可以迅速鎖定幾個樣品間的差異蛋白質(zhì)。

蛋白復合體的鑒定——在所有細胞功能中，蛋白質(zhì)間的相互作用是最基本的活動。采用TAP技術將目標靶蛋白的相互作用蛋白特異性富集，然后結合具有高靈敏度、高準確度、高通量等特點的SWATH定量，能夠高特異性的準確富集到靶蛋白的特異性相互作用蛋白，實現(xiàn)復合蛋白質(zhì)的準確鑒定。

宿主蛋白（HCPs）分析——質(zhì)譜能夠在快速有效分析HCPs的同時確保更好的準確度，TripleTOF系統(tǒng)搭配SWATH采集模式分析HCPs，可以全面、準確定量分析的同時獲得MSMS信息，一次進樣即可完成任意數(shù)量HCPs的定量分析工作，并在30分鐘的LC梯度內(nèi)，完成ppm級HCPs的含量測定。

Q：iTRAQ、SILAC和SWATH相比呢？

A：iTRAQ定量蛋白質(zhì)組方法，該方法不依賴樣本，可以做任意樣本的總蛋白質(zhì)的差異定量，而且定量準確。SILAC是僅僅適合細胞層次的蛋白質(zhì)組定量，組織的定量需要摸索或者前人已經(jīng)摸索的模式，中途測試新組織難度較大，細胞層次的SILAC培養(yǎng)費用較高。SWATH是目標蛋白質(zhì)組相關的定量模式， SWATH可以完成數(shù)千種蛋白的定量，準確度極高，通量遠高于MRM，對于亞細胞結構、細菌、真菌、細胞分泌物等樣本，SWATH效果非常好。SWATH本身對物種沒有偏向性，也是目標蛋白定量的一種，定量結果準確，可以和MRM媲美，發(fā)文章更具有說服力。

Q：采用SWATH技術對樣品有什么要求？

A：采用SWATH技術，要求樣本物種具有基因組序列、ESTs序列或蛋白質(zhì)參考序列，適合用于檢測細菌等復雜度較低的樣本，一般樣本蛋白含量至少10ug。

Q：關于“樣品重復”，技術重復和上機重復有什么區(qū)別？發(fā)表的文章一般要求幾次重復呢？

A： 一般的文章會要求做2~3次實驗重復，僅作1次實驗是有風險的，因為如果是實驗過程出現(xiàn)問題，缺乏結果的評估，往往說服力不夠，對文章發(fā)表可能構成影響。

技術重復主要目的是為了驗證試驗流程的穩(wěn)定性，當三次上級重復的結果一致或者相似時，我們可以判定對樣本的處理過程是穩(wěn)定的。上機重復的主要目的是驗證儀器的穩(wěn)定性，當三次上機結果接近或者一致，我們即可判定質(zhì)譜儀性能是穩(wěn)定的。當前的上機重復仍然在一些JPR和MCP文章中可見，即沿用了早期的習慣。而應用型的文章中，上機重復或技術重復一般沒有硬性規(guī)定，可以不做，如果做了當然最好，Editor就不會再此處找你的問題。

Q：進行SWATHTM數(shù)據(jù)處理時，建立離子數(shù)據(jù)庫的最佳方法是什么？

A：現(xiàn)在用于SWATH靶向數(shù)據(jù)處理的工作流程非常簡單，只需要多肽母離子m/z，主要碎片的m/z和相對豐度，以及保留時間。目前建立離子數(shù)據(jù)庫主要使用兩種策略：DDA采集數(shù)據(jù)蛋白鑒定或來源于外部數(shù)據(jù)庫。在第一種方法中，通過信息依賴采集方法(DDA)對樣品進行數(shù)據(jù)采集，蛋白通過ProteinPilotTM軟件或其它的搜素引擎進行鑒定，鑒定到的多肽即為用于SWATH數(shù)據(jù)處理的離子數(shù)據(jù)庫。選擇1D LCMS 或者2D LCMS技術路線取決于我們研究對象數(shù)據(jù)庫的復雜度。借助生物信息學方法，還可以對來自于外部數(shù)據(jù)庫的MSMS數(shù)據(jù)進行靶向蛋白分析，同時創(chuàng)建離子數(shù)據(jù)庫，此時需要進行保留時間校正。

Q：通過SWATHTM方法采集數(shù)據(jù)時，進行保留時間校正的最佳策略是什么？

A：通過SWATHTM軟件進行數(shù)據(jù)處理時，需要確定一個合理的窄的保留時間窗口，以避免選擇錯誤的色譜峰�，F(xiàn)在有兩種策略用于校正實際觀察到的保留時間和數(shù)據(jù)庫中的保留時間的差異。通過在樣品中增加多肽標準品，用于數(shù)據(jù)庫構建和SWATH數(shù)據(jù)采集，或者使用樣品中存在的某些已知的中等/高豐度的多肽作為參考物對保留時間進行校正。