【蛋白研究系列專題】-4丨定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，您值得擁有

1 背景和意義

  從生命活動的直接執(zhí)行者——蛋白質(zhì)的角度研究生命現(xiàn)象和規(guī)律（特別是疾病防治和病理研究）已成為研究生命科學(xué)的主要手段。而這些研究往往離不開對細(xì)胞、組織或器官中含有蛋白質(zhì)種類和表達(dá)量的研究。對處不同時期、不同條件下蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化的研究，識別功能模塊和路徑，監(jiān)控疾病的生物標(biāo)志物，這些研究都需要對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和定量。生物質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)和不斷成熟為蛋白質(zhì)差異表達(dá)分析提供了更可靠、動態(tài)范圍更廣的研究手段�；�于質(zhì)譜技術(shù)，科學(xué)家們不斷開發(fā)出新的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，來了解細(xì)胞、組織或生物體的整體蛋白質(zhì)動力學(xué)。

2 方法學(xué)介紹

  目前較主流的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法有5種，分別是Label-free、iTRAQ、SILAC、MRM(MRMHR)、和SWATH。簡述如下：

2.1  Label-free

  Label-free定量，即非標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)，不需要對比較樣本做特定標(biāo)記處理，只需要比較特定肽段/蛋白在不同樣品間的色譜質(zhì)譜響應(yīng)信號便可得到樣品間蛋白表達(dá)量的變化，通常用于分析大規(guī)模蛋白鑒定和定量時所產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

  Label-free操作簡單，可以做任意樣本的總蛋白質(zhì)差異定量，但對實驗操作的穩(wěn)定性、重復(fù)性要求較高，準(zhǔn)確性也較標(biāo)記定量差。因此，Label-free技術(shù)適合于大樣本量的定量比較，以及對無法用標(biāo)記定量實現(xiàn)的實驗設(shè)計。

2.2  iTRAQ

  iTRAQ定量是目前定量蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用最廣泛的技術(shù)， 該技術(shù)的核心原理是多肽標(biāo)記和定量，將多肽的含量轉(zhuǎn)化為114、115、116和117同位素的含量(或113、114、115、116、117、118、119和121的8標(biāo)記)，從而簡化了定量的復(fù)雜性，最終通過多肽定量值回歸到蛋白的定量值，從而最終測定出不同樣本之間蛋白質(zhì)的差異。

  iTRAQ定量不依賴樣本，可檢測出較低豐度蛋白，胞漿蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等，且定量準(zhǔn)確，可同時對8個樣本進(jìn)行分析，并可同時得出鑒定和定量的結(jié)果，特別適用于采用多種處理方式或來自多個處理時間的樣本的差異蛋白分析。金開瑞質(zhì)譜平臺應(yīng)用iTRAQ定量技術(shù)，可鑒定多達(dá)6000種蛋白（以人HepG2為例），重復(fù)樣品間的蛋白表達(dá)量相關(guān)性可達(dá)到0.95以上。

2.3  SILAC

  SILAC定量的基本原理是分別用天然同位素(輕型)或穩(wěn)定同位素(中性或重型)標(biāo)記的必需氨基酸取代細(xì)胞培養(yǎng)基中相應(yīng)氨基酸，細(xì)胞經(jīng)5-6個倍增周期后，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸完全摻入到細(xì)胞新合成的蛋白質(zhì)中替代了原有氨基酸。不同標(biāo)記細(xì)胞的裂解蛋白按細(xì)胞數(shù)或蛋白量等比例混合，經(jīng)分離、純化后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，根據(jù)一級質(zhì)譜圖中兩個同位素型肽段的面積比較進(jìn)行相對定量，屬于體內(nèi)代謝標(biāo)記法。

  SILAC屬于體內(nèi)標(biāo)記技術(shù)，更接近樣品真實狀態(tài)，標(biāo)記效率高達(dá)100%，且標(biāo)記效果穩(wěn)定，不僅適合于進(jìn)行全細(xì)胞蛋白分析，還適合于膜蛋白的鑒定和定量，每個樣本只需要幾十微克的蛋白量。SILAC定量適用于活體培養(yǎng)細(xì)胞的分析，對多個樣品或同一樣品不同條件下全細(xì)胞蛋白或亞細(xì)胞蛋白進(jìn)行差異比較。

2.4  MRM和MRMHR

  MRM是一種基于已知信息或假定信息設(shè)定質(zhì)譜檢測規(guī)則，對符合規(guī)則的離子進(jìn)行信號記錄，去除大量不符合規(guī)則離子信號的干擾，從而得到質(zhì)譜信息的一種數(shù)據(jù)獲取方式，屬于目標(biāo)蛋白質(zhì)組。其關(guān)鍵在于首先要能夠檢測到具有特異性的母離子，然后只將選定的特異性母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)，最后去除其他子離子的干擾，只對選定的特異子離子進(jìn)行質(zhì)譜信號的采集。金開瑞依據(jù)前人的工作在AB SCIEX的5600-plus 儀器上開發(fā)出了MRMHR技術(shù)，因為MRMHR采納了高精度的數(shù)據(jù)，因此選擇Transition更加可信，定量更加準(zhǔn)確。

  MRMHR技術(shù)通過兩級離子選擇，排除大量干擾離子，使質(zhì)譜的化學(xué)背景降低，目標(biāo)檢測物的信噪比顯著提高，從而實現(xiàn)檢測的高靈敏度，并具有重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高等特點，特別適合于已知蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)表達(dá)量差異驗證，可以檢測較低豐度的蛋白，但一次MRM實驗只能檢測到20個左右的目標(biāo)蛋白。

2.5  SWATH

  SWATH是瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的Ruedi Aebersold 博士及其團(tuán)隊與AB-SCIEX于2012年聯(lián)合推出的一項全新的質(zhì)譜采集模式技術(shù)，是 MS/MSALL技術(shù)的一種擴(kuò)展。與傳統(tǒng)的shot-gun技術(shù)相比，SWATH采集模式能夠?qū)�掃描區(qū)間內(nèi)所有的肽段母離子經(jīng)過超高速掃描并進(jìn)行二級碎裂，從而獲得完整的肽段信息，是一種真正全景式的、高通量的質(zhì)譜技術(shù)。金開瑞現(xiàn)有的Triple-TOF 5600-plus質(zhì)譜系統(tǒng)，使SWATH定量具有較高的準(zhǔn)確度和動態(tài)范圍，可檢測到蛋白質(zhì)的豐度差異極大，跨越4個數(shù)量級。

  應(yīng)用SWATH采集模式，一次實驗即可獲得完整的定量與定性結(jié)果，無需進(jìn)行方法優(yōu)化。它可以采集樣品中所有化合物的信息，可以對所有化合物進(jìn)行追溯、查詢和分析。定量方法采用高分辨模式，可以消除干擾，提高選擇性，且定量能力可與三重四級桿質(zhì)譜相媲美，靈敏度和動態(tài)范圍與SRM分析水平相當(dāng)。針對亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)菌、真菌、細(xì)胞分泌物等樣本，SWATH定量的效果非常好。

3 結(jié)語

  蛋白質(zhì)組學(xué)是對一個細(xì)胞或組織所表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行的系統(tǒng)分析，分析技術(shù)包括分離蛋白質(zhì)和肽的分離科學(xué)、識別和定量分析物的分析科學(xué)和數(shù)據(jù)管理和分析的生物信息學(xué)，質(zhì)譜是其關(guān)鍵性分析工具。該技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)被作為普遍的發(fā)現(xiàn)工具來動態(tài)檢測一個細(xì)胞或組織對外來或內(nèi)部干擾反應(yīng)，即定量蛋白質(zhì)組學(xué)。針對不同的樣本，不同的實驗分析目的，可選擇不同的定量分析技術(shù)。