重慶第三軍醫(yī)大學史春夢教授課題組于2016年11月14號在Gut雜志（IF：14.921）發(fā)表了名為《Identification of a fluorescent small-molecule enhancer for therapeutic autophagy in colorectal cancer by targeting mitochondrial protein translocase TIM44》的文章，首次鑒定了一種新的近紅外（NIR）熒光團自噬增強子可作為潛在的結(jié)腸直腸癌靶向藥物，我們一起來看看吧。
 
目的： 由于對自噬過程的調(diào)節(jié)有益于癌癥治療，因此鑒定新型自噬增強子具有重要意義。 然而，目前的自噬誘導抗癌劑由于其在靶外組織中的非特異性生物分布而發(fā)揮副作用。本研究旨在開發(fā)一種多功能試劑，以整合癌靶向，成像和治療，并調(diào)查其機制。
 
設計： 合成、篩選和鑒定一系列靶向線粒體的近紅外（NIR）熒光團，使其自噬活性增強，并在體外和體內(nèi)測試光學性質(zhì)和生物效應。使用抑制劑，小干擾RNA（siRNA），RNA測序，質(zhì)譜和人類樣品等研究基礎機制。
 
結(jié)果：研究者篩選并鑒定了一種新的NIR自噬增強子，IR-58，它表現(xiàn)出顯著的腫瘤選擇性殺傷作用。
 
1. IR-58合成途徑

圖1  IR-58能夠在CRC細胞中誘導自噬（圖1A）。 IR-58的化學合成方法如圖1B所示。合成化合物2和4之后，在Et 3 N催化作用下，用化合物2和4進行酰胺化反應合成關鍵中間體（化合物5，產(chǎn)率60％）。使用1H-核磁共振（1 H-NMR）測出化合物5的化學結(jié)構(gòu)。隨后，使用2,3,3-三甲基-3H吲哚和化合物5在1,2-二氯苯中進行N-烷基化反應制備吲哚季銨鹽形式的化合物6。最后，化合物6與化合物7反應用乙酸鈉作為催化劑通過縮合作用合成IR-58（1.63g，產(chǎn)率30％，綠色粘性固體）。
 
2. IR-58細胞及其動物體內(nèi)功能研究
研究者研究了在HT-29與HCT116 CRC移植瘤中，IR-58優(yōu)先于腫瘤富集的潛能。在裸鼠皮下植入人類HT-29與HCT116 CRC移植瘤，單次靜注IR-58后成像。

圖2 A,B展示了注射IR-58后移植瘤呈現(xiàn)出強烈的熒光。并通過組織病理學分析證實了IR-58碘化物在腫瘤細胞溶質(zhì)中富集。通過亞細胞定位實驗測定顯示IR-58僅累積在腫瘤細胞的線粒體中（圖D）。由于線粒體是細胞的能量中心，并且IR-58位于線粒體，研究者推測IR-58的攝取是能量依賴性的并得到了證實。（圖E，F(xiàn)）。HT-29和HCT116細胞用2-脫氧-d-葡萄糖（2-DG;糖酵解抑制劑）和寡霉素（氧化磷酸化抑制劑）預處理后發(fā)現(xiàn)2-DG顯著抑制IR-58的攝取，表明IR-58的攝取是糖酵解依賴性的，而寡霉素沒有這種效果（圖E，F(xiàn)）。當用磺基溴蛋白（BSP，OATP轉(zhuǎn)運蛋白的競爭性抑制劑）預處理HT-29和HCT116細胞后，熒光值顯著低于未處理的細胞，這表明IR-58的攝取是通過有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽（OATP）介導（圖G，H）。
 
3. IR-58的作用機制研究
 
IR-58優(yōu)先富集在結(jié)腸直腸癌（CRC）細胞和異種移植物的線粒體中，這是一種糖酵解依賴性和有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白多肽依賴性的過程。 IR-58通過誘導過度自噬（其通過活性氧（ROS）-Akt-哺乳動物類雷帕霉素靶蛋白（mTOR）途徑介導）殺死腫瘤細胞并誘導凋亡。 RNA測序，質(zhì)譜和siRNA干擾研究表明線粒體內(nèi)膜44（TIM44） - 超氧化物歧化酶2（SOD2）途徑轉(zhuǎn)位酶受抑制導致IR-58誘導過度的ROS，自噬和細胞凋亡。 TIM44表達與CRC發(fā)展和患者預后不良呈正相關。

圖3 用10μM IR-58 對HT-29, HCT116 , A549 細胞處理24小時并設置空白對照，然后進行RNA測序與質(zhì)譜分析，重疊基因的mRNA表達增加。

圖4  擬建IR-58自噬誘導機制模型。 IR-58優(yōu)先以有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽（OATP）依賴性和糖酵解依賴性方式富集在腫瘤細胞的線粒體中。 IR-58顯著抑制線粒體膜內(nèi)44（TIM44）轉(zhuǎn)位酶表達，使得超氧化物歧化酶2（SOD2）進入線粒體的攝取量減少，導致過度的活性氧（ROS）產(chǎn)生與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的去磷酸化，引發(fā)自噬。 隨后，觸發(fā)內(nèi)源性凋亡。 PARP，聚ADP-核糖聚合酶。

結(jié)論：開發(fā)了一種新型NIR小分子自噬增強子，IR-58，具有線粒體靶向成像和治療能力，用于CRC治療。此外，TIM44第一次被確定為潛在的致癌基因，其通過TIM44-SOD2-ROS-mTOR途徑在自噬中起重要作用。
 
新發(fā)現(xiàn)：IR-58被確定為優(yōu)先富集在腫瘤細胞和體內(nèi)特定目標腫瘤部位線粒體中的一種新的腫瘤自噬誘導小分子染料。
 
它在可預見的未來如何影響臨床實踐？
IR-58可能代表一種新型自噬誘導殺腫瘤小分子增強劑，而TIM44-SOD2-ROS-mTOR通路可能是臨床CRC治療的潛在靶標。 這項工作還可能提供一個潛在的策略來開發(fā)多功能小分子試劑用于成像指導的CRC治療，這可以增強腫瘤靶向的特異性和減少離體靶組織中的潛在副作用，以及使實時監(jiān)測腫瘤對治療的反應。
 
原文：Huang Y, Zhou J, Luo S, et al. Identification of a fluorescent small-molecule enhancer for therapeutic autophagy in colorectal cancer by targeting mitochondrial protein translocase TIM44[J]. Gut, 2016: gutjnl-2016-311909.
 

本研究中所用到的RNA Sequencing由銳博生物提供，所涉及到的動物實驗以及siRNA銳博生物均有提供。
 
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