周哲 江崢

賽默飛世爾科技（中國）有限公司

 

關(guān)鍵詞： 碎片離子檢索，F(xiàn)ISh，代謝物，LTQ Orbitrap

 

 

馬錢子為馬錢科植物馬錢Strychnos nux-Vomical L.的干燥成熟種子, 其主要活性成分是生物堿，具有通經(jīng)絡(luò)、消腫痛、止痛的功效, 是中醫(yī)臨床常用藥物。其中主要有效成分士的寧（strychnine）又名番木鱉堿，屬于中樞神經(jīng)興奮劑，能選擇性興奮脊髓，增強骨骼肌的緊張度，臨床用于偏癱、癱瘓及因注射鏈霉素引起的骨骼肌松弛、弱視癥等和巴比妥類中毒等。但這類成分有劇毒, 作為藥用必須嚴(yán)格控制其用量。此外，添加士的寧的飼料誘餌可用來消滅老鼠等嚙齒類有害動物。然而這些動物體內(nèi)殘留士的寧會通過食物鏈傳遞, 對整個生態(tài)圈造成影響。因此有必要建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的方法檢測該類藥物, 為臨床用藥、環(huán)保、司法等部門提供可靠的分析手段和數(shù)據(jù)。

 

本文采用高效液相色譜-離子阱靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對士的寧及其代謝產(chǎn)物進行了全面的分析，利用線性離子阱技術(shù)對目標(biāo)化合物進行MSn多級碎裂，并通過Orbitrap靜電場軌道阱技術(shù)獲得一級和多級質(zhì)譜的高分辨質(zhì)譜信息。Mass Frontier 7.0結(jié)構(gòu)解析軟件具有豐富的裂解機理數(shù)據(jù)庫能夠進行準(zhǔn)確的碎片歸屬，其獨有的碎片離子檢索（Fragment Ion Search, FISh）功能將母藥和代謝物共有碎片及代謝途徑有機結(jié)合到一起，可以檢獲代謝物的全面信息。

 

 

2.1 液相色譜條件：

儀器：Accela HPLC system液相色譜儀

色譜柱：Thermo Scientific Hypersil Gold C18 （100×2.1 mm, 1.9 μm）流動相：A為水相：0.05%甲酸 2 mM甲酸銨水溶液，B為有機相：0.05%甲酸 2 mM甲酸銨乙腈溶液

 

梯度條件：

 

流速0.2 mL/min，進樣量：5 μL，柱溫為30℃

 

儀器：Thermo LTQ Orbitrap XL

質(zhì)譜離子源參數(shù)：ESI Spray voltage：+4.0 KV；Sheath Gas Pressure：35 arb；Aux Gas Pressure： 8 arb；Capillary Temp：275℃； Scan mode：Full MS with data-dependent MSn；CID（collision energy 35%，activation time 30 ms）；Scan range： m/z 200~700。

 

按5 mg/kg劑量口服喂食雄性大鼠士的寧，6小時后取大鼠尿樣，SPE固相萃取純化富集，取適量稀釋后進樣分析。

 

 

采用Mass Frontier的聯(lián)合組分檢測（Joint Components Detection）算法，對質(zhì)譜數(shù)據(jù)中的代表性組分進行查找�；�于所有離子輪廓圖最大值的統(tǒng)計分析，通過提取各個質(zhì)譜峰豐度輪廓圖，可創(chuàng)建出士的寧母藥及其他可能代謝物的“純凈”質(zhì)譜樹，并生成相應(yīng)的峰形（圖1）。

 

 

圖1. 聯(lián)合組分檢測（Joint Components Detection）算法查找代表性組分

 

在獲得士的寧“純凈”質(zhì)譜樹后，使用Mass Frontier碎裂數(shù)據(jù)庫（Fragmentation Library），可快速的對士的寧碎片結(jié)構(gòu)進行歸屬，該數(shù)據(jù)庫幾乎涵蓋了所有已發(fā)表的文獻，所以在快速解析碎片的同時，可獲得完整的碎片裂解途徑，并可方便的調(diào)用查看所引用的文獻情況，保證了碎片解析的準(zhǔn)確性（圖2）。

 

 

圖2. 破裂數(shù)據(jù)庫（Fragmentation Library）歸屬士的寧碎片及裂解途徑

 

LTQ Orbitrap XL的線性離子阱相比傳統(tǒng)三維離子阱具有更高的離子容量，故具有優(yōu)異的多級質(zhì)譜能力，能夠高效的捕獲前級離子進行碎裂，并獲得高靈敏度的碎片離子信息，在對士的寧母離子的采集過程中，獲得了其四級有效質(zhì)譜信息（MS4）。通過多級質(zhì)譜解析，總結(jié)出士的寧完整裂解機理，為未知代謝物檢索帶來有價值的信息（圖3）。

 

 

圖3. 士的寧MS4離子樹及完整裂解機理

 

碎片離子檢索功能利用母藥和代謝物的結(jié)構(gòu)相關(guān)性，采用母藥的特征質(zhì)譜碎片，結(jié)合代謝途徑，完成對未知代謝物的檢索。利用該功能，在完成了士的寧母藥的質(zhì)譜裂解規(guī)律后，將特征碎片導(dǎo)入FISh模塊中，并選擇可能的代謝途徑，結(jié)合代表性組分查找，檢索士的寧未知代謝物的全面信息（圖4）。

 

 

圖4.碎片離子檢索士的寧未知代謝物工作流程

 

通過碎片離子檢索獲得準(zhǔn)確全面的未知代謝物信息，包含未知代謝物色譜信息、一級多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)、未知代謝物代謝途徑等信息，同時FISh 解釋功能還可以通過母藥及代謝物多級質(zhì)譜信息之間的比對，進一步對代謝位點進行推測（圖5）。

 

 

圖5.士的寧未知代謝物檢索鑒定結(jié)果

 

以RT 11.5 min的未知代謝物為例，通過FISh計算，獲知該未知代謝物為羥基化代謝產(chǎn)物，通過FISh解釋功能比對264.1、280.0、323.1、334.2、238.0 m/z等特征碎片，推測出該代謝物為16-Hydroxystrychnine（圖6）。

 

 

圖6.士的寧代謝物16-Hydroxystrychnine

 

使用相同處理方法，共檢測到士的寧26個代謝產(chǎn)物，其中一相代謝產(chǎn)物22個，二相代謝產(chǎn)物4個，見表1。

 

表1. 士的寧代謝產(chǎn)物鑒定結(jié)果

 

 

4.1 Thermo LTQ Orbitrap XL質(zhì)譜儀將線性離子阱與高分辨靜電場軌道阱Orbitrap 檢測技術(shù)相結(jié)合，提供優(yōu)異的性能和出色的多功能性。線性離子阱更高的離子容量能夠高效的捕獲前級離子進行多級碎裂，獲得高質(zhì)量的多級質(zhì)譜圖，本實驗通過線性離子阱逐級裂解剖析了士的寧完整裂解機理。Orbitrap技術(shù)具備高分辨高質(zhì)量精度（HR/AM）的能力，本實驗中士的寧代謝產(chǎn)物質(zhì)量偏差<3 ppm，能夠有效的排除干擾，獲得代謝物準(zhǔn)確的元素組成。

 

4.2 Mass Frontier為Thermo專業(yè)的結(jié)構(gòu)解析軟件，利用其豐富的碎裂數(shù)據(jù)庫（Fragmentation Library），可快速的對士的寧多級碎片結(jié)構(gòu)進行了準(zhǔn)確推測和歸屬，在快速解析碎片的同時，可獲得完整的碎片裂解途徑，并可方便的調(diào)用查看所引用的文獻情況，保證了碎片解析的準(zhǔn)確性。母藥和代謝物存在結(jié)構(gòu)相關(guān)性，質(zhì)譜多級碎裂后可能生成共有碎片，碎片離子檢索（FISh）功能將這種相關(guān)性與可能的代謝途徑有機的結(jié)合起來，從繁雜的基質(zhì)樣品質(zhì)譜信號中準(zhǔn)確的篩選到未知代謝物信息，通過比對母藥和代謝物多級質(zhì)譜信息， FISh解釋功能更可進一步對代謝位點進行推測。