活性藥物成分（API）和成品藥的雜質(zhì)分析是藥物研發(fā)中不可或缺的一環(huán)。雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息在評(píng)估毒性、改進(jìn)合成途徑，以及根據(jù)目標(biāo)成藥選擇最佳劑型至關(guān)重要。

 

為保證藥效與消費(fèi)者的安全，世界各國(guó)的監(jiān)管機(jī)構(gòu)都制定了藥物雜質(zhì)分析的指引，清楚說(shuō)明基于日服用量、使用時(shí)間，和藥物靶標(biāo)的限量標(biāo)準(zhǔn)。

 

LCMS 已經(jīng)成為最常用的未知雜質(zhì)分析技術(shù)。為了能在大量母藥中識(shí)別并表征痕量雜質(zhì)，具有高靈敏度、高掃描速度，并且能進(jìn)行多級(jí)質(zhì)譜分析（MSn） 的質(zhì)譜儀必不可少。

 

在本研究中，Sigma-Aldrich 所售的研究級(jí)阿德福韋酯（adefovir dipivoxil，ADP） 被用來(lái)作為模型化合物進(jìn)行API 雜質(zhì)分析。ADP 是廣泛用于慢性乙肝病毒感染的一種抗病毒處方藥。本研究中使用的LCMS 系統(tǒng)由Thermo Scientific AccelaTM UHPLC 以及 Velos ProTM 線(xiàn)性離子阱質(zhì)譜儀構(gòu)成。碎片信息通過(guò)結(jié)合應(yīng)用 CID 與Trap-HCD 解離技術(shù)獲得。數(shù)據(jù)處理通過(guò)軟件Mass FrontierTM 完成。

 

 

材料與試劑

阿德福韋酯（Adefovir dipivoxil，CAS# 142340-99-6）從Sigma-Aldrich 購(gòu)得，產(chǎn)品號(hào)A9730。

乙腈和水 （Fisher）；乙酸銨（Sigma-Aldrich，產(chǎn)品號(hào)73594-25G-F）；甲酸（Sigma-Aldrich，產(chǎn)品號(hào)33015-500ml）。

 

ADP 溶液，0.5mg/mL，用1 ml 20 : 80 的乙腈和水混合溶劑溶解0.5mg ADP 獲得。

 

HPLC 系統(tǒng)：Thermo Accela 1250 泵，開(kāi)放式Accela 自動(dòng)進(jìn)樣器及Accela PDA

色譜柱： Hypersil GOLD C18 2.1×150 mm，3 μM，

Thermo Scientific 產(chǎn)品號(hào) 071399

柱溫：35 ℃

流速：0.5 ml/ 分鐘

進(jìn)樣體積：8 μl

流動(dòng)相：A – 水，B – 乙腈，C - 100 mM 乙酸銨，用乙酸調(diào)至pH 5

梯度洗脫：

 

 

質(zhì)譜儀：配有 HESI-II 離子源的Velos ProTM 線(xiàn)性離子阱離子化條件：電噴霧， 正離子模式

1. 全掃模式 m/z 120-1000 amu/ Top5 dd MS/MS，HCD NCE 35%

2. 全掃模式/ 按母離子列表dd MS2/ TOP 3 ddMS3,CID/ Trap-HCD NCE 20%

a. CID MS² / CID MS³

b. CID MS² / HCD MS³

c. HCD MS² / CID MS³

d. HCD MS² / HCD MS³

 

 

 

ADP 雜質(zhì)譜分析流程由兩次連續(xù)的LCMS實(shí)驗(yàn)構(gòu)成。分析目標(biāo)是為雜質(zhì)鑒定和結(jié)構(gòu)解析收集盡可能多的信息。第一個(gè) MS 實(shí)驗(yàn)包括全掃描和后續(xù)的 Top5 HCD 數(shù)據(jù)依賴(lài)MS/MS 掃描（圖1）。 接下來(lái)，數(shù)據(jù)通過(guò)MassFrontier 當(dāng)中的Fragment Ion Search（碎片離子檢索，F(xiàn)ISh）算法進(jìn)行處理，這是一個(gè)新穎的進(jìn)行雜質(zhì)檢出及鑒定的方法，主要基于母離子解離模式的比較（圖2a，b）。與母藥擁有相同碎片的成分會(huì)被“FISh”識(shí)別出來(lái)，見(jiàn)圖3。

 

 

圖1.阿德福韋酯的質(zhì)譜總離子流圖

 

 

圖2. 用Mass Frontier“FISh”算法檢測(cè)出雜質(zhì)成分

 

標(biāo)注：FISh 檢測(cè)到的成分

 

 

圖3. “FISh”算法檢測(cè)出的雜質(zhì)成分的XIC

 

進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)信息通過(guò)結(jié)合母化合物列表、使用Trap-HCD 和CID 解離組合進(jìn)行MS² 實(shí)驗(yàn)獲得。

 

當(dāng)歸一化的碰撞能量水平相同時(shí)，Trap-HCD 比 CID 生成的碎片譜圖信息更豐富。Trap-HCD 沒(méi)有低質(zhì)量數(shù)歧視效應(yīng)，見(jiàn)圖4。CID MSn 能夠提供步進(jìn)的裂解信息，對(duì)結(jié)構(gòu)解析非常有價(jià)值，見(jiàn)圖5，6。

 

 

圖4. 阿德福韋酯在相同的 25%NCE水平下的CID & HCD MS² 譜圖

 

- 全掃，CID dd MS²（設(shè)定母離子列表），然后對(duì)前三的MS²碎片離子進(jìn)行 HCD MS³

- 全掃, CID dd MS² （設(shè)定母離子列表），然后對(duì)前三的MS²碎片離子進(jìn)行 CID MS³

- 全掃, HCD dd MS² （設(shè)定母離子列表），然后對(duì)前三的MS²碎片離子進(jìn)行 CID MS³

- 全掃, HCD dd MS² （設(shè)定母離子列表），然后對(duì)前三的MS²碎片離子進(jìn)行 HCD MS³

 

 

圖5. 雜質(zhì)m/z 558.19的CID與HCD譜圖比對(duì)

 

 

圖6. 雜質(zhì) m/z 388.13的CID和HCD MS² , MS³譜圖

 

 

圖 7. Sigma-Aldrich所售研究級(jí)阿德福韋酯（adefovir dipivoxil）樣品中所含雜質(zhì)的可能結(jié)構(gòu)式

 

根據(jù)豐富的HCD、CID  MS²和  MS³ 碎片信息（見(jiàn)圖7），對(duì)鑒定出的雜質(zhì)化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。每個(gè)雜質(zhì)組分的精確質(zhì)量數(shù)和元素組成通過(guò)臺(tái)式Orbitrap Q ExactiveTM 質(zhì)譜儀的高分辨數(shù)據(jù)確認(rèn)。

 

表1. 雜質(zhì)組分的精確質(zhì)量數(shù)和元素組成通過(guò)Q Exactive 高分辨數(shù)據(jù)確認(rèn)

 

 

 

兩種解離技術(shù)—Trap-HCD 和CID—被用來(lái)表征市售研究級(jí)阿德福韋酯（adefovir dipivoxil）樣品中的十三種低含量雜質(zhì)。當(dāng)歸一化的碰撞能量水平相同時(shí)，Trap-HCD 比CID 生成的碎片譜圖信息更豐富。Trap-HCD 不存在低質(zhì)量歧視效應(yīng)。另一方面，CID 能夠提供逐級(jí)裂解信息和MSⁿ 譜圖，對(duì)于闡明子結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)非常有價(jià)值。本研究的結(jié)果證明，結(jié)合數(shù)據(jù)后處理軟件使用這兩種互補(bǔ)的解離方式能夠出色完成雜質(zhì)鑒定與結(jié)構(gòu)解析，提高了未知雜質(zhì)分析的速度與可靠性。

 

藥物雜質(zhì)分析解決方案--離子阱多級(jí)液質(zhì)