劉國強(qiáng)

賽默飛世爾科技（中國）有限公司

 

巴西蜂膠；液相色譜；質(zhì)譜；異戍二烯基肉桂酸衍生物

 

建立了同時(shí)測定巴西蜂膠中27 種活性化合物的反相高效液相色譜- 離子阱靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（HPLC-MS）的分析方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙醇：水（8：2）比乙酸乙酯：甲基叔丁基醚（1：1）和甲基叔丁基醚：甲醇（9：1）提取出更多的酚酸類成分。通過Orbitrap Elite 獲得的多級質(zhì)譜，從巴西蜂膠中共鑒定出27 個(gè)成分，包含11 個(gè)黃酮類化合物，15 個(gè)酚酸類化合物，和1 個(gè)有機(jī)酸類化合物。其中異戍二烯基肉桂酸衍生物，為巴西蜂膠中的一類重要的生理活性成分，本實(shí)驗(yàn)中鑒別出的阿體匹林C （Artepillin C）和Drupanin 可作為巴西蜂膠質(zhì)量控制方面的標(biāo)記物。此分析方法可以用于蜂膠的化學(xué)成分的分析和商業(yè)上的巴西蜂膠制品的質(zhì)量鑒定。

 

蜂膠是蜜蜂采集膠源性植物的樹脂摻和其上腭腺及蠟腺分泌物，經(jīng)蜜蜂反復(fù)加工涂到蜂巢入口、內(nèi)壁，以保持巢內(nèi)相對無菌狀態(tài)的膠狀物質(zhì)，是一種稀有的、珍貴的蜂產(chǎn)品。蜂膠具有諸多的活性作用，如抗菌 ，抗炎鎮(zhèn)痛，降膽固醇，抗腫瘤等 。蜂膠中主要的有效成份是黃酮類化合物和酚酸類化合物，此外還含有脂肪酸、氨基酸、萜烯類化合物、礦物質(zhì)、維生素、胰蛋白酶等化學(xué)成分。

 

巴西蜂膠 （Brazilian Bee Propolis） 是指產(chǎn)于巴西的蜂膠，其外觀與成分等與世界其他地區(qū)的蜂膠有較大差別。 巴西東南部蜂膠中異戊二烯苯丙類含量豐富，在巴西蜂膠中具有藥理活性的是異戊二烯基肉桂酸衍生物，其中四個(gè)是帶有異戊二烯雜環(huán)的苯并吡喃，巴西蜂膠因含有一種“阿特匹林C”的特殊成分，被世界蜂膠業(yè)追捧，素有“世界蜂膠看巴西”的說法。

 

隨著蜂膠產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，蜂膠被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域，蜂膠中阿魏酸、咖啡酸苯乙酯等主要活性物質(zhì)的含量多少也直接影響到蜂膠的生理活性。僅用黃酮類化合物的含量來控制蜂膠質(zhì)量已不能滿足要求。因此，對蜂膠的化學(xué)成分進(jìn)行綜合全面的分析對建立蜂膠的指紋圖譜和評價(jià)蜂膠質(zhì)量具有重要的意義。本文采用高效液相色譜- 離子阱靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對來自巴西的蜂膠膠囊樣品的化學(xué)成分進(jìn)行了全面的分析，在優(yōu)化的液質(zhì)條件下，利用Obitrap Elite 對樣品中的各個(gè)色譜峰進(jìn)行了精確分子量測定，并在1 ppm的質(zhì)量偏差范圍內(nèi)擬合出唯一可能的元素組成，再結(jié)合多級質(zhì)譜的碎片裂解規(guī)律和數(shù)據(jù)庫的篩查，從巴西蜂膠中共鑒定出了27 個(gè)主要成分。

 

甲醇，乙醇，乙酸乙酯，甲基叔丁基醚，和乙腈( 色譜純，德國Merck)，甲酸( 優(yōu)級純，Merck)；取巴西蜂膠膠囊樣品，研細(xì)，稱取0.5g 置于具塞錐形瓶中，分別加入乙醇：水（8：2），乙酸乙酯：甲基叔丁基醚，或甲基叔丁基醚：甲醇，超聲提取30 分鐘，用0.22μm 微孔濾膜濾過后，直接進(jìn)樣分析。

 

儀器： Dionex UltiMate 3000 液相色譜儀

色譜柱：Thermo Scientific Syncronis C18 (150×2.1mm, 5μm)

流動(dòng)相梯度：A 為水相：0.1% 甲酸水，B 為有機(jī)相：乙腈

 

流速0.35 mL/min，進(jìn)樣量：2 μL，檢測波長為254 nm，柱溫為30℃。

 

儀器：Thermo Elite 雙壓線性離子阱- 高分辨靜電場軌道阱組合型質(zhì)譜儀

質(zhì)譜參數(shù)：HESI Spray voltage: +3.5KV/-3.0KV; Sheath Gas Pressure: 35arb; Aux Gas Pressure: 10arb; Capillary Temp: 320 ℃ ;

Heater Temp: 300℃ ; Scan mode: Full MS(Resolution 60,000)，and MS2-5(Resolution 17,500，NCE 30); Scan range: m/z 100~1000。

 

 

巴西蜂膠成分復(fù)雜，采用等度洗脫很難將蜂膠中的多種組分分離，因此本文采用梯度洗脫方式分離蜂膠組分。在選定的色譜條件下，考察不同提取溶劑對蜂膠中活性成分的提取效率。樣品中的化學(xué)成分分別用乙醇：水（8 : 2），乙酸乙酯：甲基叔丁基醚（1 : 1），和甲基叔丁基醚：甲醇（9 : 1）進(jìn)行提取，其所得254nm 檢測波長下的色譜圖，及在正負(fù)離子模式下的總離子流圖(TIC) 如圖 1 所示。由紫外吸收圖可知乙酸乙酯：甲基叔丁基醚（1 : 1）和甲基叔丁基醚：甲醇（9 : 1）提取出的樣品成分相似，乙醇：水（8 : 2）在9 min 前多出現(xiàn)了一些色譜峰。

 

由上文可知，蜂膠中的化學(xué)成分在乙醇：水（8 : 2）的條件下提取效率較高，圖2 為樣品在此提取條件下254nm檢測波長下的色譜圖，及在正負(fù)離子模式下的總離子流圖(TIC) 如下所示，由圖可知樣品中化學(xué)成分在ESI 負(fù)離子模式條件下具有較好響應(yīng)，正離子模式因受聚乙二醇的干擾，對信號的抑制較大。離子流圖中所標(biāo)示的1-27為蜂膠中所鑒定出的主要成分。

 

 

 

正離子模式下，10 min 前可見響應(yīng)很強(qiáng)的一系列峰，其中1.97，2.70，3.43，和4.14min 處峰的一級質(zhì)譜如圖3 所示：

 

圖3. ESI 正離子模式下1.97，2.70，3.43，和4.14min 處峰的一級質(zhì)譜圖。

 

在正負(fù)離子模式下，以C，H，O，和N 在1ppm 偏差范圍內(nèi)，從一級質(zhì)譜圖擬合元素組成，可得[M+H]+ m/z 195.12283，239.14906，283.17523，和327.20157 唯一的元素組成分別為C8H19O5，C10H23O6，C12H27O7，和C14H31O8，此四峰間分子式均相差C2H4O，應(yīng)為聚乙二醇類化合物。

 

如下圖4 所示， 正離子模式下，[M+H]+ m/z 195.12283，239.14906，283.17523，和327.20157 的二級質(zhì)譜圖可見其主要的碎片離子為丟失C2H4O 或H2O 所得的碎片離子。由碎片離子m/z 89.05966 可知此聚乙二醇的端基為羥基。故可知正離子模式下出現(xiàn)的一系列化合物為聚乙二醇HO(CH2CH2O)nH，其為巴西蜂膠膠囊樣品中的輔料成分。

 

圖4. [M+H]+ m/z 195.12283，239.14906，283.17523，和327.20157 的二級質(zhì)譜圖。

 

成分9，10 和11 的多級質(zhì)譜如下圖5，6，和7 所示，負(fù)離子模式下均可見[M-H]－ m/z 515.11859。在負(fù)離子模式下，以C，H，O，和N 在1ppm 偏差范圍內(nèi)，從一級質(zhì)譜圖擬合元素組成，可得其分子式均為C25H24O12，三者互為同分異構(gòu)體。

 

在負(fù)離子模式下，成分9，10 和11 [M-H] － m/z 515.11859的二級質(zhì)譜圖可見其主要的碎片離子為丟失咖啡酰基C9H6O3 所得的基峰離子m/z 353.08694；三級質(zhì)譜圖中可見m/z 353.08694 主要的碎片離子為丟失咖啡酰基C9H6O3所得碎片離子m/z 191.05588，丟失奎寧酸C7H10O5 所得碎片離子m/z 179.03482，丟失咖啡酸C9H8O4 所得碎片離子m/z 173.04544。

 

圖5. 成分9 在ESI 負(fù)離子模式下的多級質(zhì)譜圖。

 

圖6. 成分10 在ESI 負(fù)離子模式下的多級質(zhì)譜圖。

 

圖7. 成分11 在ESI 負(fù)離子模式下的多級質(zhì)譜圖。

 

對于成10 而言，三級質(zhì)譜圖含有特征性基峰離子m/z191.05588，對于成分9 和11 來說，特征性碎片離子m/z173.04544 為基峰離子，由碎片離子相對豐度可知成分9，10 和11 分別為4,5- 二咖啡�？鼘幩�4,5-di-O-caffeoyquinic acid；3,5- 二咖啡酰奎寧酸3,5-di-O-caffeoyquinic acid；和3,4-二咖啡�？鼘幩�3,4-di-O-caffeoyquinic acid。

 

利用Obitrap Elite 對樣品中的各個(gè)色譜峰進(jìn)行了精確分子量測定，并在1 ppm 的質(zhì)量偏差范圍內(nèi)擬合出唯一可能的元素組成，再結(jié)合多級質(zhì)譜的碎片裂解規(guī)律和數(shù)據(jù)庫的篩查，在巴西蜂膠樣品中共鑒定出27 個(gè)主要成分，其結(jié)構(gòu)和主要的碎片離子分別如圖8 和表1 所示。

 

圖8. 巴西蜂膠樣品中鑒定出的27 個(gè)成分的結(jié)構(gòu)式。

 

表 1. 巴西蜂膠樣表品1. 中巴西鑒蜂定膠出樣的品中2鑒7 個(gè)定出成的分2其7 個(gè)主成要分的其主碎要片的離碎子片離和子化和合化物合名物名稱。

 

 

 

3.1 Thermo Scientific Orbitrap Elite 質(zhì)譜儀將雙壓線性離子阱與高分辨的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)（HR/AM）Orbitrap 檢測技術(shù)相結(jié)合，提供優(yōu)異性能和出色多功能性。其多級質(zhì)譜MSn 能力有助于同分異構(gòu)體的鑒定，如本實(shí)驗(yàn)中的4,5- 二咖啡�？鼘幩�，3,5- 二咖啡酰奎寧酸，和3,4- 二咖啡酰奎寧酸而言，可通過三級質(zhì)譜圖中碎片離子相對豐度加以區(qū)別。

 

3.2 本實(shí)驗(yàn)中乙酸乙酯：甲基叔丁基醚（1 : 1）和甲基叔丁基醚：甲醇（9 : 1）提取出的樣品成分相似。乙醇：水（8 : 2）在9 min 前出現(xiàn)了一些酚酸類化合物，其提取效率較高。

 

3.3 在巴西蜂膠膠囊樣品中聚乙二醇輔料干擾的情況下，通過Orbitrap Elite 獲得的多級質(zhì)譜，仍從中共鑒定出27個(gè)主要成分，包含11 個(gè)黃酮類化合物，15 個(gè)酚酸類化合物，和1 個(gè)有機(jī)酸類化合物。本實(shí)驗(yàn)中鑒別出的阿體匹林C （Artepillin C） 和Drupanin 可作為巴西蜂膠質(zhì)量控制方面的標(biāo)記物。此分析方法可以用于蜂膠的化學(xué)成分的分析和商業(yè)上巴西蜂膠制品的質(zhì)量鑒定。