張曉夕

賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司

 

目前，在對(duì)包括癌癥在內(nèi)的各種疾病的診斷和治療中，單克隆抗體（mAbs）起到了越來(lái)越重要的作用，其相關(guān)研究發(fā)展也十分迅速。不同于傳統(tǒng)的小分子藥物，單克隆抗體的結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，存在多種異構(gòu)現(xiàn)象，故單克隆抗體結(jié)構(gòu)表征就顯得尤為重要。由于生物質(zhì)譜所具有的“軟電離”模式和高靈敏度、高質(zhì)量精度和寬動(dòng)態(tài)范圍等優(yōu)點(diǎn)，在單克隆抗體分子量測(cè)定、蛋白序列測(cè)定、翻譯后修飾分析及雜質(zhì)分析等方面，質(zhì)譜正在起到越來(lái)越重要的作用。

 

離子阱質(zhì)譜經(jīng)常被用于未知物的結(jié)構(gòu)解析，以及常規(guī)的蛋白序列測(cè)定、翻譯后修飾和糖鏈結(jié)構(gòu)解析等。已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用LTQ Velos 離子阱質(zhì)譜可以對(duì)小的完整蛋白（16kDa）進(jìn)行top down 解析[1]；然而，使用離子阱質(zhì)譜對(duì)150kDa 的完整單克隆抗體進(jìn)行完整分子量測(cè)定尚未見報(bào)道。

 

 

在本文的研究中我們使用Velos Pro 雙壓線性離子阱質(zhì)譜，對(duì)完整單克隆抗體及其輕重鏈分別進(jìn)行了分子量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，離子阱質(zhì)譜也能對(duì)150kDa 的完整單克隆抗體進(jìn)行分子量測(cè)定，且不同糖型可得到分辨。

 

本次實(shí)驗(yàn)使用完整單克隆抗體樣品，樣品濃度2μg/μL；取部分樣品上樣至常規(guī)液相色譜，經(jīng)在線脫鹽后質(zhì)譜測(cè)定其分子量；另取部分完整單克隆抗體樣品經(jīng)二硫蘇糖醇（DTT）對(duì)二硫鍵還原烷基化后上樣至LC-MS 系統(tǒng)，分別測(cè)定輕、重鏈分子量。

 

色譜儀：Thermo Scientific Accela 600

色譜柱：Thermo BioBasic 8 HPLC（5μm, 2.1mm, 100mm）

上樣量：4μL（8μg）

流動(dòng)相：A: 0.1% 甲酸水溶液，B: 0.1% 甲酸乙腈溶液梯度如下，其中前四分鐘為在線除鹽過(guò)程：

 

質(zhì)譜儀：Velos Pro 線性離子阱質(zhì)譜儀

噴霧電壓：3.8 kV

毛細(xì)管溫度：275 ℃

S-lens：66.8%

Scan Rate：Normal

m/z range：800-3500

In source CID：75eV

AGC target：3e5

 

數(shù)據(jù)使用ProMass 軟件進(jìn)行去卷積分析。

 

 

 

圖1. LTQ Velos Pro 測(cè)定完整單克隆抗體分子量原始譜圖

 

 

圖2. 對(duì)圖1 譜圖進(jìn)行去卷積

 

由圖1 及圖2 可以看出：首先，使用Velos pro 雙壓線性離子阱質(zhì)譜對(duì)完整單克隆抗體（150kD）進(jìn)行分子量測(cè)定，得到的譜圖中可見不同電荷態(tài)的峰均勻分布（圖1）；對(duì)其使用ProMass 軟件進(jìn)行去卷積分析，可知所測(cè)單克隆抗體分子量為147491Da，且不同糖型得到分辨（圖2）。

 

使用DTT 對(duì)完整單克隆抗體進(jìn)行還原處理后，分別對(duì)抗體的輕、重鏈進(jìn)行分子量測(cè)定，結(jié)果如下：

 

 

圖3. LTQ Velos Pro 測(cè)定單克隆抗體輕鏈分子量

 

 

圖4. LTQ Velos Pro 測(cè)定單克隆抗體重鏈分子量

 

由圖3 及圖4 可以看出，對(duì)于DTT 處理后的單克隆抗體，分別測(cè)定其輕、重鏈分子量，同樣可得不同電荷態(tài)的峰均勻分布的譜圖；經(jīng)去卷積后，分別可以得到輕、重鏈的分子量。其中重鏈部分的雜峰較多（圖4），可能為不同糖型及單抗發(fā)生降解所導(dǎo)致。

 

在本文的研究中，我們使用Velos Pro 雙壓線性離子阱對(duì)完整單克隆抗體及其輕重鏈進(jìn)行了分子量測(cè)定。結(jié)果表明：首先，對(duì)于完整單克隆抗體，離子阱質(zhì)譜可以實(shí)現(xiàn)分子量測(cè)定并分辨出不同糖型；對(duì)于經(jīng)DTT 還原后的輕、重鏈，離子阱質(zhì)譜同樣可以測(cè)定其分子量和不同糖型。離子阱質(zhì)譜可滿足傳統(tǒng)定性分析需求，是未知化合物結(jié)構(gòu)解析的強(qiáng)大武器；在蛋白質(zhì)藥物研究方面，被廣泛用于肽圖分析、序列鑒定和翻譯后修飾研究等。通過(guò)本文的研究，我們證明了離子阱質(zhì)譜同樣可以用于單克隆抗體分子量的測(cè)定。

 

同時(shí)，由于離子阱質(zhì)譜可對(duì)化合物進(jìn)行多級(jí)質(zhì)譜解析，在肽段的翻譯后修飾研究、尤其是糖鏈的精細(xì)結(jié)構(gòu)解析中起到不可或缺的作用。另外，雙壓線性離子阱Velos Pro同時(shí)具有高壓和低壓阱，高壓阱提供最大化離子捕獲、裂解和隔離效率，低壓阱提供其他離子阱質(zhì)譜所無(wú)法比擬的分辨率和掃描速率。綜上，離子阱質(zhì)譜亦為生物制藥行業(yè)相關(guān)分析的有力工具。

 

[1] Tonya Pekar Second, Joshua J. Coon, Vlad Zabrouskov. A Novel Dual-Pressure Linear Ion Trap Mass Spectrometer Improves the Analysis of Complex Protein Mixtures[J]. Anal Chem. 2009 September 15; 81(18): 7757–7765.