李靜

賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司

 

TSQ Quantiva；肽段定量；靈敏度

 

生物標(biāo)志物的研究包括發(fā)現(xiàn)（Discovery），驗(yàn)證（Verification），確認(rèn)（Validation） 階段， 最后進(jìn)入臨床檢驗(yàn)（Clinical Utilization）等更深入的階段。在研究生物標(biāo)志物的過(guò)程中，主要的挑戰(zhàn)在于如何在成分復(fù)雜的生物樣品中發(fā)現(xiàn)中等豐度或低豐度的蛋白質(zhì)，這就對(duì)儀器性能提出了很高的要求，即儀器必須具備高靈敏度，以保證低豐度蛋白質(zhì)的檢出。

 

TSQ Quantiva 是賽默飛世爾科技在2013 年ASMS 上推出的全新一代三重四極桿質(zhì)譜儀。TSQ Quantiva 采用主動(dòng)離子管控技術(shù)(Active Ion Management，AIM)（圖1）技術(shù)優(yōu)化離子生成及從離子源至檢測(cè)器的傳輸，使這款儀器能夠以最優(yōu)異的靈敏度定量分析最復(fù)雜和最具挑戰(zhàn)性的樣品。本實(shí)驗(yàn)旨在考查T(mén)SQ Quantiva 在復(fù)雜基質(zhì)中針對(duì)目標(biāo)肽段定量的靈敏度。

 

 

圖1. 主動(dòng)離子管控技術(shù)（AIM）示意圖

 

PIERCE Peptide Retention Time Calibration Mixture（貨號(hào): 88320），內(nèi)含15 條不同疏水系數(shù)（Hydrophobicity Factor, HF）的重標(biāo)肽段。采用5ng/μL E.coli 酶解產(chǎn)物進(jìn)行逐級(jí)稀釋，獲得濃度為0.0005 fmol/ μL, 0.0025 fmol/ μL, 0.005 fmol/ μL, 0.05 fmol/μL, 0.5 fmol/ μL, 5 fmol/ μL, 50 fmol/ μL 的樣品。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)Pinpoint 1.3 軟件進(jìn)行離子對(duì)的選擇（圖2），每個(gè)母離子選擇4 個(gè)子離子，其中1 個(gè)子離子作為定量離子，3 個(gè)子離子作為定性離子。最終建立了15 條目標(biāo)肽段，共計(jì)60個(gè)離子對(duì)的SRM 方法，其中加粗部分為定量離子（表1）。

 

圖2. Pinpoint 1.3 軟件進(jìn)行離子對(duì)的選擇

 

表1. 15 條肽段信息

 

 

高效液相色譜儀: Thermo Scientific EASY-nLC 1000

預(yù)柱：Dionex PepMap C18 色譜柱（2cm, ID75μm, 3μm）

分析柱：Dionex PepMap C18 色譜柱（15cm, ID75μm, 3μm）

流動(dòng)相：A，含0.1% 甲酸的水溶液；B，含0.1% 甲酸的乙腈溶液

梯度： 2%-5% B 2 min，2%-45% B 42min，45%-90% B 3 min，90%B 3min

流速：300 nL/min

上樣量: 2 μL

 

質(zhì)譜儀：Thermo Scientific TSQ Quantiva

離子源：NanoFlex 離子源

離子模式：正離子

噴霧電壓：2.0 KV

毛細(xì)管溫度：275 ℃

Q1 and Q3 resolution: 0.7 Da;

Cycle time：2s

碰撞能量：通過(guò)公式CE=0.034 × 母離子的m/z + 5.314 計(jì)算得到相應(yīng)肽段的碰撞能量，并在此基礎(chǔ)上CE加減2 進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，選擇最優(yōu)碰撞能量。

 

本實(shí)驗(yàn)采用全新一代三重四極桿質(zhì)譜TSQ Quantiva 對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中15 條重標(biāo)肽段進(jìn)行定量分析，均可獲得良好的色譜峰形和質(zhì)譜響應(yīng)（圖3）。以肽段SSAAPPPPPR* 為例，檢出限為（LOD）1amol，定量下限（LLOQ）為5amol（圖4）。如圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線所示，在5amol-100fmol 五個(gè)數(shù)量級(jí)濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積的線性相關(guān)系數(shù)在0.99 以上，同時(shí)，在amol 級(jí)水平仍可獲得良好重復(fù)性（圖6）。15 條肽段的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍參見(jiàn)表2。

 

 

圖3. 15 條肽段總離子流圖（TIC）（上樣量100fmol）

 

 

圖4. 肽段SSAAPPPPPR* 不同上樣量提取離子流圖（EIC）m/z493.8-> m/z 335.7

 

 

圖5. 肽段SSAAPPPPPR* 標(biāo)準(zhǔn)曲線

 

 

圖6. 肽段SSAAPPPPPR* 在amol 水平重復(fù)性

 

表2. 15 條肽段標(biāo)曲和線性范圍

 

 

實(shí)驗(yàn)表明，得益于主動(dòng)離子管控技術(shù)（AIM），TSQ Quantiva在復(fù)雜基質(zhì)中針對(duì)目標(biāo)肽段的定量靈敏度表現(xiàn)突出，極大地提升了TSQ 質(zhì)譜平臺(tái)定量復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)肽段的能力，適用于復(fù)雜生物學(xué)樣本中低豐度蛋白質(zhì)的分析，可用于潛在生物標(biāo)志物的確證工作。