張偉 賽默飛世爾科技

譚青喬 中信國(guó)健藥業(yè)

 

糖基化修飾是生命活動(dòng)中最廣泛、最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，不僅影響著蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、生物活性、運(yùn)輸和定位，而且在分子識(shí)別、細(xì)胞通信、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等特定生物過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。糖蛋白根據(jù)其糖鏈結(jié)構(gòu)及糖基化位點(diǎn)主要有N-糖蛋白與O-糖蛋白兩大類(lèi)。據(jù)推斷，有超過(guò)50%的蛋白質(zhì)都發(fā)生了糖基化修飾，但由于糖基化的高度復(fù)雜性，絕大多數(shù)糖蛋白尚未被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中只有約10%的蛋白質(zhì)被注釋為糖蛋白[1]。首先，糖鏈的組成與結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，糖鏈為非模板合成且呈二維結(jié)構(gòu)，糖苷鍵連接位置和構(gòu)象的不同都會(huì)形成差異的精細(xì)結(jié)構(gòu)。據(jù)報(bào)道，僅僅由6 個(gè)不同單糖組成的寡糖鏈，其結(jié)構(gòu)就可能達(dá)到驚人的1012種[2]。其次，當(dāng)組成與結(jié)構(gòu)各異的糖鏈連接在蛋白質(zhì)上形成糖蛋白時(shí)，又構(gòu)成微觀不均一性，即糖基化位點(diǎn)上糖鏈結(jié)構(gòu)多樣化的問(wèn)題，一個(gè)蛋白可能存在多個(gè)糖基化位點(diǎn)，而每個(gè)位點(diǎn)上又可能存在多種結(jié)構(gòu)的糖鏈[3]。

 

隨著以單抗為代表的糖蛋白藥物的開(kāi)發(fā)，質(zhì)譜已廣泛應(yīng)用于糖基化解析，通常先利用酶切或化學(xué)手段將糖鏈從糖蛋白釋放，再分別進(jìn)行糖基化位點(diǎn)的鑒定和糖鏈結(jié)構(gòu)的解析[4]。然而針對(duì)完整糖肽的解析，目前尚無(wú)成熟技術(shù)。本文利用新一代組合型質(zhì)譜LTQ-Orbitrap Elite具有的HCD/ETD“雙碎裂模式”，解析一種復(fù)雜糖蛋白的完整糖肽，利用最新Byonic與SimGlycan軟件解析，成功發(fā)現(xiàn)2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，16個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，83種位點(diǎn)特異性糖鏈組成與結(jié)構(gòu)信息，在未脫糖狀態(tài)下使蛋白序列覆蓋度高達(dá)92.1%。

 

 

樣品為某種重組表達(dá)的高度糖基化蛋白，前處理使用二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酸（IAA）對(duì)二硫鍵還原烷基化，胰蛋白酶（Trypsin）酶解蛋白，最終濃度為1.5 μg/μL。

 

色譜柱：納流速C18 (2 μm, 100 A, 75 μm x 50 cm)，常規(guī)流速HILIC-NH2 (3 μm, 100 A, 2.0 mm x 15 cm)

色譜儀：C18柱使用納流速液相Easy-nLC 1000，HILIC-NH2柱使用常規(guī)流速液相Accela 600上樣量：2 μL

流動(dòng)相：A: 0.1%甲酸水溶液，B: 0.1%甲酸乙腈溶液

梯度：C18: 3%-90% B, 120 min, 250 nL/min; HILIC-NH2: 95%-5% B,120 min, 200 μL/min

 

質(zhì)譜儀：LTQ-Orbitrap Elite組合型高分辨質(zhì)譜儀

離子源：

Easy-nLC 1000使用EASY-Spray納流電噴霧離子源：噴霧電壓2.3 kV，傳輸毛細(xì)管溫度：275°C，S-Lens：60%；

Accela 600使用HESI-II加熱電噴霧離子源：噴霧電壓3.5 kV，

鞘氣：30，輔助氣：10，傳輸毛細(xì)管溫度：275°C，SLens：60%

掃描方式：數(shù)據(jù)依賴(lài)性掃描：一級(jí)全掃描（分辨率60,000），Top15二級(jí)全掃描（分辨率15,000）；掃描范圍：母離子m/z 400-3500，子離子m/z 100-3500；動(dòng)態(tài)排除：時(shí)間30s，排除范圍m/z -0.5~+1.5

碎裂模式：高能碰撞誘導(dǎo)解離HCD（NCE 35%），電子轉(zhuǎn)移解離ETD（100 ms for 2+）

 

數(shù)據(jù)使用Byonic軟件搜庫(kù)鑒定糖肽/非糖肽，具體參數(shù)為：酶：trypsin (KR)；專(zhuān)一性：全酶切；漏切位點(diǎn)：2；母離子質(zhì)量精度：15 ppm；子離子質(zhì)量精度：20 mD；固定修飾：C+58.005；可變修飾：M+15.995；糖基化修飾：N, O；肽段卡值標(biāo)準(zhǔn)：Score>150，Delta Mod>5，Log Probability<-1；糖基化位點(diǎn)卡值標(biāo)準(zhǔn)：Score>190，Delta Mod>10，Log Probability<-2。SEQUEST搜庫(kù)參數(shù)相同，卡值標(biāo)準(zhǔn)為5%FDR。糖肽糖鏈部分結(jié)構(gòu)使用SimGlycan軟件解析。

 

 

實(shí)驗(yàn)整體策略見(jiàn)圖1。本實(shí)驗(yàn)采用nano-C18與氨基HILIC兩種分離方式分別對(duì)樣本進(jìn)行色譜分離。C18是常用的蛋白/肽段分離色譜柱，而納流速的C18柱使被分析物的單位濃度顯著提高，靈敏度達(dá)到最佳，能夠有效分析低豐度/低離子化效率的肽段。氨基HILIC屬親水色譜，根據(jù)寡糖/聚糖組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分離，是糖鏈結(jié)構(gòu)解析、糖組學(xué)研究的有效工具。

 

同時(shí)，由于目標(biāo)蛋白的糖基化高度復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用HCD與ETD兩種碎裂模式進(jìn)行質(zhì)譜采集。HCD傾向于碎裂低電荷/低分子量的肽段，存在糖基化修飾時(shí)，優(yōu)先碎裂單糖之間的糖苷鍵，同時(shí)高能碎裂能夠獲得更充分的碎片信息。ETD傾向于碎裂高電荷/高分子量的肽段，存在糖基化修飾時(shí)，優(yōu)先碎裂肽段骨架的酰胺鍵。因此，HCD與ETD具有良好的互補(bǔ)性，兩者結(jié)合可以有效應(yīng)用于完整糖肽的解析。

 

 

圖1. 糖肽解析流程圖

 

糖肽譜圖同時(shí)含有肽骨架與糖鏈的碎片信息，因此質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解析也是分析難點(diǎn)。Byonic是專(zhuān)業(yè)的糖肽解析軟件，采用創(chuàng)新的“Preview”算法和豐富的糖鏈組成數(shù)據(jù)庫(kù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)肽段、糖基化位點(diǎn)的鑒定，并根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)給出糖鏈組成。SimGlycan是專(zhuān)業(yè)的糖鏈結(jié)構(gòu)解析軟件，含有9650種糖鏈的理論碎片信息，是目前最大的商品化糖數(shù)據(jù)庫(kù)。本實(shí)驗(yàn)先使用Byonic對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行序列鑒定，獲得糖基化位點(diǎn)與糖鏈的單糖組成信息，再使用SimGlycan對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行糖鏈結(jié)構(gòu)解析，最終獲得糖肽序列、糖基化位點(diǎn)與位點(diǎn)特異的糖鏈結(jié)構(gòu)。

 

 

圖2. 樣本LC-MS/MS總離子流圖（TIC）

 

圖2展示了樣本經(jīng)nano-C18+HCD流程分析獲得的TIC圖，色譜峰分布均勻，達(dá)到理想分離效果，質(zhì)譜響應(yīng)達(dá)9次方。所有質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)Byonic進(jìn)行序列鑒定，蛋白序列覆蓋度達(dá)92.1%，而使用傳統(tǒng)算法SEQUEST進(jìn)行搜庫(kù)，序列覆蓋度只有76.6%（圖3）。

 

 

圖3. (A) SEQUEST/Byonic序列鑒定覆蓋度對(duì)比；(B) Byonic對(duì)肽段二級(jí)譜圖匹配

 

SEQUEST算法無(wú)法鑒定完整糖肽，只能根據(jù)未發(fā)生糖基化的肽段分析序列，一些完全發(fā)生糖基化的肽段難以解析。相反，Byonic鑒定時(shí)根據(jù)其糖鏈數(shù)據(jù)庫(kù)，將糖基化作為可變修飾，因而能夠直接解析糖肽。因此，Byonic解析糖蛋白序列覆蓋度顯著提高。

 

在上述Byonic鑒定結(jié)果中，共包含28條糖肽，對(duì)應(yīng)18個(gè)糖基化位點(diǎn)，其中，N-糖基化位點(diǎn)2個(gè)，O-糖基化位點(diǎn)16個(gè)；同時(shí)，共獲得位點(diǎn)特異的糖鏈組成83種，對(duì)應(yīng)到每個(gè)位點(diǎn)最多17種，最少1種，平均每個(gè)位點(diǎn)5.2種。HCD與ETD兩種碎裂模式顯示出優(yōu)異的互補(bǔ)性，使解析結(jié)果明顯增多（圖4）。

 

 

圖4. HCD/ETD碎裂獲得的糖肽解析結(jié)果比較

 

通過(guò)比較TKPREEQYNSTYR這條N-糖肽（N317）的質(zhì)譜譜圖（圖5）可以看出，ETD與HCD都成功鑒定到這條糖肽，而ETD所獲得的碎片信息（c/z）更加豐富，位點(diǎn)同時(shí)被c、z離子覆蓋。相反，HCD所獲得的碎片信息（b/y）明顯減少，位點(diǎn)沒(méi)有被碎片離子覆蓋。但值得注意的是，HCD譜圖的高分子量端出現(xiàn)顯著的簇峰，峰之間相差162Da（Δm/z 81, 2+）或203 Da（Δm/z 101.5, 2+），表明糖肽的糖鏈部分發(fā)生碎裂。

 

 

圖5. 糖肽TKPREEQYNSTYR的HCD/ETD碎裂譜圖解析

 

ETD傾向于碎裂較強(qiáng)的肽骨架氨基酸之間的酰胺鍵，保留修飾基團(tuán)，因此該糖肽在ETD中完整保留了糖鏈，獲得較為充分的肽骨架碎片（c/z系列），能夠更加有效鑒定肽段。HCD傾向于碎裂較弱的翻譯后修飾基團(tuán)，造成該糖肽的糖鏈在HCD模式下發(fā)生顯著碎裂，呈現(xiàn)一系列相隔一個(gè)單糖的碎片峰，而肽骨架的碎裂被顯著抑制，b/y系列離子不充分且信號(hào)較弱；同時(shí)，帶有完整糖鏈的碎片難以產(chǎn)生，因此無(wú)法得到包含位點(diǎn)N的b/y碎片信息。

 

對(duì)于糖鏈較小的O-糖肽，HCD對(duì)糖鏈的影響沒(méi)有N-糖肽那么大，而且ETD碎裂的信號(hào)響應(yīng)（103）明顯要弱于HCD（104），因此綜合而言，兩者鑒定到的糖肽和位點(diǎn)數(shù)量相當(dāng)，展現(xiàn)了優(yōu)異的互補(bǔ)性。

 

Byonic不考慮糖鏈碎片信息，只根據(jù)肽段碎片的精確分子量搜庫(kù)得到糖鏈的組成信息，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步使用SimGlycan分析糖鏈具體結(jié)構(gòu)。SimGlycan根據(jù)糖鏈碎片信息解析糖鏈結(jié)構(gòu)，因此在解析具體結(jié)構(gòu)的同時(shí)，也從另一方面對(duì)Byonic的鑒定結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，使最終結(jié)果更加可信。

 

 

圖6. 糖肽TKPREEQYNSTYR的HCD碎裂譜圖糖鏈解析

 

本實(shí)驗(yàn)對(duì)所有鑒定到N317糖基化位點(diǎn)譜圖進(jìn)行SimGlycan解析，最終75.6%的譜圖得到驗(yàn)證，相應(yīng)93.8%的糖鏈獲得結(jié)構(gòu)信息。如表1所示，N317位點(diǎn)共有15種糖鏈結(jié)構(gòu)，主要為高甘露糖型與雙鏈復(fù)雜型N-糖鏈，還包含了核心巖藻糖、唾液酸等重要結(jié)構(gòu)。圖6進(jìn)一步展示了圖5中HCD譜圖的糖鏈結(jié)構(gòu)解析結(jié)果及部分碎片匹配圖，充分的糖鏈碎片離子信息表明Hex2HexNAc8的結(jié)構(gòu)為三分支的高甘露糖型。

 

Byonic不考慮糖鏈碎片信息，只根據(jù)肽段碎片的精確分子量搜庫(kù)得到糖鏈的組成信息，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步使用SimGlycan分析糖鏈具體結(jié)構(gòu)。SimGlycan根據(jù)糖鏈碎片信息解析糖鏈結(jié)構(gòu)，因此在解析具體結(jié)構(gòu)的同時(shí)，也從另一方面對(duì)Byonic的鑒定結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，使最終結(jié)果更加可信。

 

表1. N317位點(diǎn)的糖鏈結(jié)構(gòu)

 

 

另外，糖鏈存在諸多同分異構(gòu)體，特別是組成一致，連接方式不同的精細(xì)結(jié)構(gòu)差異，僅靠二級(jí)碎片難以區(qū)分。當(dāng)然，LTQ-Orbitrap Elite所具有的多級(jí)解析能力（MSn），同樣能夠針對(duì)糖鏈實(shí)現(xiàn)有效的精細(xì)結(jié)構(gòu)解析。

 

本文使用新一代組合型質(zhì)譜LTQ-Orbitrap Elite，利用技術(shù)領(lǐng)先的HCD/ETD“雙碎裂模式”，結(jié)合先進(jìn)的糖基化解析軟件Byonic與Simglycan，成功解析了一種高度糖基化蛋白的完整糖肽。實(shí)驗(yàn)共獲得2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，16個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，83種位點(diǎn)特異性糖鏈組成與結(jié)構(gòu)，在未脫糖狀態(tài)下蛋白序列覆蓋度高達(dá)92.1%，最大化地實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜糖蛋白的高效解析。技術(shù)領(lǐng)先的LTQ-Orbitrap Elite是糖組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物制藥領(lǐng)域復(fù)雜大分子解析的強(qiáng)大工具。

 

[1] Apweiler, R.; Hermjakob, H.; Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database [J]. Biochim. Biophys. Acta 1999, 1473 (1): 4-8.

[2] Morelle, W.; Canis, K.; Chirat, F.; Faid, V.; Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation [J]. Proteomics 2006, 6 (14): 3993-4015.

[3] 代景泉，蔡耘，錢(qián)小紅；蛋白質(zhì)糖基化分析方法及其在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通訊 2005, 16 (3): 287-292.

[4] Geyer, H.; Geyer, R. Strategies for analysis of glycoprotein glycosylation [J]. Biochim. Biophys. Acta 2006, 1764 (12): 1853-1869.