雜質(zhì)分析對(duì)于藥物的研發(fā)至關(guān)重要1。在研究過(guò)程中，雜質(zhì)譜信息能幫助藥物化學(xué)家優(yōu)化合成路線和避免潛在的有毒雜質(zhì)。在開(kāi)發(fā)過(guò)程中，當(dāng)大量母體化合物存在時(shí)，鑒定和表征痕量雜質(zhì)至關(guān)重要，從而促進(jìn)了高分辨率、高靈敏度和高掃描速度的HR-MS 儀器和智能化結(jié)構(gòu)鑒定軟件的發(fā)展。

 

為了展示HR-MS 在雜質(zhì)分析和結(jié)構(gòu)鑒定方面的能力，本文選用了市售藥物奧美拉唑。本研究采用了賽默飛世爾科技的Q Exactive 臺(tái)式Orbitrap 質(zhì)譜儀和數(shù)據(jù)處理軟件Mass Frontier 來(lái)快速分析和鑒定奧美拉唑中雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

 

奧美拉唑（CAS# 73590-58-6）購(gòu)自Sigma-Aldrich，產(chǎn)品號(hào)O104-100MG。

乙腈和水來(lái)自Fisher Scientific

乙酸銨購(gòu)自Sigma-Aldrich，產(chǎn)品號(hào)73594-25G-F。

甲酸購(gòu)自Sigma-Aldrich，產(chǎn)品號(hào)33015-500ml。

 

奧美拉唑溶液（0.5 mg/mL）配制在1:1 乙腈/ 水混合溶劑中。

 

色譜分離采用Ultimate3000 UHPLC 系統(tǒng)。

色譜柱：Hypersil GOLD 柱，2.1mm×150mm，粒徑3 μm.

柱溫：35 ℃，流速：0.5 mL/min，進(jìn)樣體積：8 μL

流動(dòng)相：A - 水；B - 乙腈；C -100 mM 乙酸銨，用乙酸調(diào)節(jié)pH 值到5

 

 

梯度洗脫：

 

質(zhì)譜分析采用 Q Exactive 質(zhì)譜儀的電噴霧正離子模式。在70,000 和 35,000 分辨率FWHM@m/z 200 下分別采集高分辨全掃描一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)依賴Top3 二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

 

離子源條件：

離子化模式：正離子ESI

離子源：HESI-II

鞘氣流速：45 單位N2

輔助氣流速：10 單位N2

噴霧電壓（KV）：+3.5

毛細(xì)管柱溫度（℃）：320

S-lens RF 水平：50.0

加熱器溫度（℃）：400

 

Q Exactive 方法參數(shù)：

AGC 目標(biāo)（全掃描）：3e6

AGC 目標(biāo)（MS/MS）：1e5

NCE：30，35% 階梯變化

掃描范圍（全掃描MS）：180 到1200 amu

 

采集得到奧美拉唑的高分辨率全掃描和三個(gè)最高強(qiáng)度的數(shù)據(jù)依賴HCD MS/MS 數(shù)據(jù)。HRAM 全掃描和MS/MS 數(shù)據(jù)提供了分子量和碎片信息。HCD（高能量碰撞解離）得到了豐富的MS/MS 碎片和低質(zhì)量端碎片信息。利用Mass Frontier 軟件與這些信息互相配合，我們不僅快速檢測(cè)出奧美拉唑的主要雜質(zhì)，而且可靠地測(cè)定了相應(yīng)的元素組成，如圖1&2 和表1 所示。

 

圖1. 奧美拉唑的質(zhì)譜總離子流圖

 

 

圖2. 奧美拉唑的高分辨率準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)全掃描和MS/MS 譜圖

 

 

圖3. Mass Frontier 的FISh 功能鑒定雜質(zhì)

 

表1. 已識(shí)別雜質(zhì)的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)和元素組成

 

 

采用Mass Frontier 的“ 碎片離子搜索”（FISh） 功能處理HRAM 全掃描和MS/MS 數(shù)據(jù)， 見(jiàn)圖3-a。FISh 能輕易識(shí)別出與母體化合物具有相同碎片離子的化合物，見(jiàn)圖3-b，并根據(jù)碎片推斷出可能的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖7。通過(guò)搜索Mass Frontier 的HighChem 譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)，Mass Frontier的“Fragment and Mechanism（碎片和機(jī)理）”功能可以提供推薦結(jié)構(gòu)的參考文獻(xiàn)。每個(gè)推薦結(jié)構(gòu)的“Fragment andMechanism”結(jié)果對(duì)于理解結(jié)構(gòu)來(lái)源提供了很好的幫助。將數(shù)據(jù)結(jié)果與“Fragment and Mechanism”進(jìn)行比較，為推薦結(jié)構(gòu)提供了更多的確認(rèn)/ 否定標(biāo)準(zhǔn)。

 

Mass Frontier 的另一個(gè)重要特色是“碎片結(jié)構(gòu)的注解圖譜”，用于碎片的自動(dòng)預(yù)測(cè)。三個(gè)同分異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)鑒定演示了這個(gè)功能，見(jiàn)圖4 和5。

 

 

圖4. m/z 為376.1331 的雜質(zhì)的三個(gè)同分異構(gòu)體

 

 

圖5-a. RT 8.1 min 的m/z 為376.1331 的雜質(zhì)的MS/MS 譜圖

 

 

圖5-b. RT 8.5 min 的m/z 為376.1331 的雜質(zhì)的MS/MS 譜圖

 

 

圖5- c. RT 11.2 min 的m/z 為376.1331 的雜質(zhì)的MS/MS 譜圖

 

 

*9’和10’是9 和10 的同分異構(gòu)體。

圖7. 奧美拉唑雜質(zhì)的推薦結(jié)構(gòu)

 

Q Exactive 臺(tái)式Orbitrap 系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)全掃描和MS/MS 數(shù)據(jù)的高分辨率準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)測(cè)定（HRAM），為未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定提供至關(guān)重要的分子量和結(jié)構(gòu)信息：HRAM 全掃描準(zhǔn)確測(cè)定元素組成，而HRAM MS/MS 能準(zhǔn)確測(cè)定雜質(zhì)成分。

 

Mass Frontier 碎片離子搜索（FISh） 和“Fragment and Mechanism”功能，通過(guò)搜索HighChem 碎片數(shù)據(jù)庫(kù)準(zhǔn)確鑒定未知物的結(jié)構(gòu)。

 

由Q Exactive HRAM 數(shù)據(jù)和Mass Frontier 軟件組成的工作流程能幫助研究人員在藥物研究的早期高效準(zhǔn)確地鑒定每批次API 中的雜質(zhì)。

 

1.FDD Guidance for Industry, Q3A (R2) Impurities in New Drug Substances