Olaf Scheibner, Maciej Bromirski, Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany

 

Q Exactive Focus，Orbitrap，獸藥，HRAM定量，HRAM篩查，vDIA，未知物篩查，回顧性數(shù)據(jù)分析

 

本實驗利用可變數(shù)據(jù)非依賴采集（vDIA），建立了一種獸藥分析的新方法。該法具備高靈敏度和高選擇性，能夠獲得被測樣品全面而高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，并可將定量分析與非目標(biāo)物和未知物篩查相結(jié)合。

 

考慮到樣品預(yù)處理和質(zhì)譜分析的復(fù)雜性，動物源食品中的獸藥殘留分析通常是一個費時的過程。利用傳統(tǒng)方法對動物源食品（包括肉、奶和血漿）中多類獸藥殘留進(jìn)行定量分析，常常需要多次進(jìn)樣以獲得各類成分的最佳分析條件，包括針對不同種類化合物而開發(fā)的不同色譜和質(zhì)譜方法。并且所獲數(shù)據(jù)僅僅包含目標(biāo)化合物的信息，而不適用于其它化合物的回顧性分析。

 

本實驗使用超快速液相色譜和Thermo ScientificTM Q Exactive FocusTM臺式 OrbitrapTM質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)建立了一種新方法，其包含快速色譜方法和可變數(shù)據(jù)非依賴采集（vDIA）質(zhì)譜方法。該法具有總分析時間短、選擇性高和靈敏度高等優(yōu)點，并且其采集的數(shù)據(jù)能夠用于其它目標(biāo)物和非目標(biāo)物篩查。本實驗利用vDIA方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對樣品中已知和未知目標(biāo)化合物進(jìn)行分析。vDIA允許設(shè)置多個MS/MS隔離窗口，窗口寬度可從50Da到800Da。通常較小的窗口寬度用于低質(zhì)量區(qū)域以擴(kuò)展動態(tài)范圍和提高靈敏度，較大的窗口寬度用于更高質(zhì)量區(qū)域以改善工作周期。該法的典型方法設(shè)置如本文所示，用5組MS/MS隔離窗口覆蓋全掃描的整個質(zhì)量數(shù)范圍，同時保持MS/MS分析速度與快速色譜分離相匹配。

 

 

 圖1 Q Exactive Focus臺式Orbitrap質(zhì)譜儀

 

如表1所示，分析成分為44個不同種類的獸藥殘留，分析樣品包括肌肉、腎臟、牛奶和血漿提取物，所有樣品均采用相同的標(biāo)準(zhǔn)化色譜和質(zhì)譜方法進(jìn)行分析。為了進(jìn)行絕對定量分析，44個濃度已知的獸殘標(biāo)準(zhǔn)品被配制成8個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（從100pg/mL （ppt）到500ng/mL （ppb））。采用高分辨、高質(zhì)量精度的（HRAM）LC-MS/MS方法，分析基質(zhì)加標(biāo)樣品（肌肉和腎臟中加入抗生素標(biāo)樣、牛奶中加入阿維菌素類標(biāo)樣、血漿中加入硝酸咪唑類標(biāo)樣）以評價方法。

 

表1 目標(biāo)化合物及其定量限（LOQ）

 

所有樣品均采用以下液相色譜方法：

 

質(zhì)譜方法采用全掃描和寬隔離窗口的可變數(shù)據(jù)非依賴采集(FS-vDIA)方法：

 

使用Thermo ScientificTM TraceFinderTM 3.2版軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。提取離子流色譜圖采用5ppm的提取窗口。為了進(jìn)行非目標(biāo)篩查，使用一個包括450種組分的數(shù)據(jù)庫，該庫中內(nèi)置了各種組分及其碎片m/z值。

 

分析物的定量基于全掃描信息（準(zhǔn)分子離子）。另外，根據(jù)歐盟的法規(guī)要求（EC/657/2002），1至5個碎片離子用于定性確認(rèn)，在上述濃度范圍內(nèi)獲得線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 

本文介紹的vDIA方法能夠?qū)⑷珤呙钄?shù)據(jù)依賴MS²（FS-ddMS²）和全范圍碎片掃描模式（比如全部離子碎裂AIF模式）二者有機結(jié)合起來。如圖2所示，其將一個全掃描和數(shù)個寬范圍隔離窗口的MS²掃描相結(jié)合。在此設(shè)置中，MS²隔離窗的寬度從100Da到500Da不等，幾個隔離窗口共同覆蓋了先前全掃描的整個質(zhì)量范圍。

 

 

圖2. 一個典型的FS-vDIA實驗設(shè)置

 

FS-ddMS²方法的MS²掃描是對全掃描中檢出的目標(biāo)化合物（在母離子列表中）進(jìn)行MS²掃描，其獲得的碎片離子信息具有很高的選擇性和靈敏度。對于其它關(guān)注的化合物，由于缺乏MS/MS定性確認(rèn)，F(xiàn)S-ddMS2方法的回顧性數(shù)據(jù)分析僅基于精確質(zhì)量數(shù)的全掃描定量。

 

全范圍碎片掃描模式如AIF，其全掃描中所有化合物的碎片都在一次MS²掃描中檢測，其優(yōu)勢在于可以采集樣品中所有可能的全掃描和MS²掃描信息，因此，該方法尤其適用于回顧性數(shù)據(jù)分析。但是由于分析物本身的復(fù)雜性，導(dǎo)致每種化合物的碎片離子數(shù)量有限，因此，該方法的動態(tài)范圍、選擇性和檢出限等方面存在一定局限性。

 

在vDIA方法中，碎片離子分布在多個寬范圍隔離窗口中，這些窗口覆蓋了完整的質(zhì)量數(shù)范圍。該方法具備相當(dāng)高的靈敏度和選擇性，同時保持了樣品信息的完整性，因而非常適用于回顧性數(shù)據(jù)分析。表1中的定量限（LOQs）是以逐級稀釋法進(jìn)行全掃描定量并結(jié)合碎片離子定性確證得出的。定量限此處定義為，至少能以一個碎片離子進(jìn)行定性確證的最低化合物濃度。

 

對于準(zhǔn)確定量和定性確認(rèn)，用于定性確證的碎片離子需在保留時間和質(zhì)量數(shù)兩方面均能充分分辨，以免受到升高的背景或干擾峰的影響。圖3舉例說明，使用vDIA掃描模式和TraceFinder軟件自動化處理所提取的定性碎片離子（右邊面板）與定量母離子的離子色譜圖重疊度和匹配度均很高。所有的定性離子不受干擾，且和定量離子同時流出，使定性結(jié)論毋庸置疑，這點對于復(fù)雜基質(zhì)樣品的分析特別重要。在vDIA模式下，能得到所有共流出碎片的輪廓圖，因此通過碎片色譜峰積分并計算碎片離子比，也能夠?qū)Χㄐ越Y(jié)果進(jìn)行更可靠的確證。

 

 

圖3. 基質(zhì)中所選化合物的選擇性：A. 豬肉中加入5ppb氨芐西林；B. 豬腎臟中加入5ppb磺胺嘧啶；C. 豬血中加入1ppb洛硝噠唑；D. 牛奶中加入1ppb莫西菌素。

 

 

圖4. 所選化合物的線性

 

對于阿維菌素和多拉菌素，實驗發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)分子離子穩(wěn)定性不好，因此全掃描檢測的靈敏度不高。這種不穩(wěn)定性可能是由于采用了該通用方法的平均參數(shù)。在這種情況下，vDIA方法可以選用阿維菌素和多拉菌素的幾個碎片離子進(jìn)行定量，在這種模式下，相比全掃描模式而言，即使離子濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于準(zhǔn)分子離子濃度，也能夠完成可靠的定量和定性確認(rèn)。

 

建立了定量曲線后，對低濃度基質(zhì)加標(biāo)樣品中所有組分進(jìn)行定量分析。肌肉和腎臟樣品中加入5ppb抗生素，牛奶中加入1.0ppb阿維菌素，血漿中加入1.0ppb硝基咪唑類獸藥。

 

在以保留時間進(jìn)行全掃描識別的分析中，TraceFinder處理軟件為組分檢測提供很高的選擇性（使用 5 ppm的窄提取窗口）。該軟件還提供另外三種自動定性確證方式。第一種方式是通過全掃描中母離子的同位素信息進(jìn)行確證。圖5為環(huán)丙沙星實測（紅色）和理論（藍(lán)色）的同位素分布疊加圖。將分辨率設(shè)定為70,000，即使在如肌肉提取物的復(fù)雜基質(zhì)中，某個化合物的濃度低至5ppb，其同位素分布的匹配仍不受干擾，確保了定性結(jié)果的可靠性。

 

第二種方式是通過MS/MS數(shù)據(jù)檢測已知碎片離子進(jìn)行定性確證。以下結(jié)果為0.5ppb肌肉組織加標(biāo)樣的檢測結(jié)果。圖6為vDIA模式下碎片離子確證的結(jié)果。由于vDIA譜圖采用一個寬隔離窗口生成，因此可以檢測多個母離子產(chǎn)生的碎片離子。Orbitrap MS/MS具備的高分辨率和高質(zhì)量精度特性，使得碎片離子的選擇性識別成為可能，結(jié)合保留時間，可獲得可靠的確證結(jié)果。

 

 

圖5. 環(huán)丙沙星的同位素譜圖匹配，紅色為實測譜圖，藍(lán)色為理論同位素分布圖

 

 

圖6. 環(huán)丙沙星的碎片匹配結(jié)果，紅色為實測譜圖，藍(lán)色為確證碎片離子質(zhì)量數(shù)