前言

強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)?zāi)芙沂靖鞣N環(huán)境因素對(duì)原料藥和制劑的影響。它能提供藥品安全信息、確定推薦儲(chǔ)存條件、保質(zhì)期和分析方法的特異性。而降解產(chǎn)物的信息能幫助改進(jìn)化合物或配方的發(fā)展。

霉酚酸酯（MMF）的商標(biāo)名稱為驍悉（CellCept），是一種免疫抑制劑和霉酚酸（MPA）的前體藥物。 MMF 廣
泛的應(yīng)用在治療器官移植排異反應(yīng)和自體免疫疾病的移植藥物中。本研究選擇 MMF 作為模型化合物。

本文開(kāi)發(fā)了一種快速可靠的分析霉酚酸酯降解產(chǎn)物的完整工作流程，使用的儀器是賽默飛世爾科技的 Accela^TM
UHPLC 系統(tǒng)和臺(tái)式 Orbitrap Q Exactive FocusTM 質(zhì)譜儀，數(shù)據(jù)處理采用 Mass FrontierTM 軟件。霉酚酸酯在熱和過(guò)氧化物催化下的降解研究的 pH 值設(shè)定為 2.0、 3.5、 6.0 和 8.2。采用 HRAM 全掃描和數(shù)據(jù)依賴MS/MS 在高分辨率和極性切換模式下實(shí)現(xiàn)降解產(chǎn)物的快速鑒定。 HRAM MS 和 MS/MS 譜圖以及正 / 負(fù)離子模式切換，能可靠完成降解產(chǎn)物的定性和結(jié)構(gòu)鑒定。

實(shí)驗(yàn)方法

材料與試劑

霉酚酸酯 API CAS# 128794-94-5 購(gòu)自 2A PharmaChem（Lisle， IL），純度 >98%。
霉酚酸酯降解產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品
霉酚酸， CAS# 24280-93-1 Sigma-Aldrich。
霉酚酸酯雜質(zhì) G， CAS# 224052-51-1， Molcan Corporation，加拿大多倫多
霉酚酸酯雜質(zhì) A， CAS# 1322681-36-6， Molcan Corporation，加拿大多倫多
鹽酸、乙酸銨、氫氧化鈉和過(guò)氧化氫購(gòu)自 Sigma-Aldrich。

樣品前處理

● 霉酚酸酯儲(chǔ)備液，濃度為 2.5 mg/mL 的乙腈溶液，稱取 25 mg 標(biāo)準(zhǔn)品配制在 10 mL 乙腈中。
● 鹽酸（0.01 N， pH 2），乙酸銨（5 mM， pH 6），氫氧化鈉（0.01 N， pH 8）和過(guò)氧化氫（3%， pH 8.2）。購(gòu)買(mǎi)的 30% 過(guò)氧化氫用水稀釋 10 倍后用于酸、堿和氧化研究。用氫氧化銨或乙酸調(diào)節(jié)強(qiáng)制降解溶液 pH 值。
● 用如上 pH 2、 pH 6、 pH 8 的溶液和過(guò)氧化氫（3%， pH 8.2）將濃度為 2.5 mg/mL 的霉酚酸酯儲(chǔ)備液稀釋 10倍配制濃度為 0.25 mg/mL 的強(qiáng)制降解溶液。強(qiáng)制降解溶液放置于 60℃烘箱中。在放置的第 1、 20、 48 和 72小時(shí)分別取樣，直接進(jìn)樣到 LC/MS 中進(jìn)行分析。

HPLC 方法

HPLC 系統(tǒng)： Thermo Scientific Accela 1250 pump, Open Accela Autosampler and Accela PDA
色譜柱： Thermo Scientific Dionex Acclaim 2.1×150 柱 , 2.2 μm
柱溫箱溫度： 35℃
流動(dòng)相：A - 0.1% 甲酸水溶液
            B – 含 0.1% 甲酸的乙腈
            C - 100 mM 甲酸銨的水溶液（pH 5）
梯度洗脫： 0-0.5 min 保持 20% B，然后在 15 min 內(nèi)線性增加到 40%B
流速： 500 μL/min
進(jìn)樣體積： 1 μL

質(zhì)譜方法

質(zhì)譜儀： Thermo Scientific Q Exactive Focus 臺(tái)式高分辨質(zhì)譜
儀，配備 HESI-II 離子源
離子化模式： ESI 正 / 負(fù)離子切換
全掃描采集： m/z 120-1000 amu，分辨率為 70,000（FMHW@m/z 200）
MS/MS 采集： 35,000 分辨率下響應(yīng)強(qiáng)度數(shù)據(jù)依賴采集
HCD 碰撞能量： 35%， 25% 階梯變化

結(jié)果與討論

I. UHPLC- 高分辨率 MS 快速測(cè)定降解產(chǎn)物

采用 UHPLC- 高分辨率 MS 快速分析降解產(chǎn)物。高質(zhì)量的 HRMS 全掃描圖譜為測(cè)定降解產(chǎn)物的元素組成提
供了重要信息，并從隨后的數(shù)據(jù)依賴 MS/MS 獲得分子離子的裂解信息。

II. 高分辨率 MS/MS 鑒定降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)

具備階梯式碰撞能量的高分辨高能碰撞解離功能產(chǎn)生了信息量豐富的碎片，能更輕松地完成降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定。

III. 極性切換功能全面鑒定降解產(chǎn)物

快速正 / 負(fù)離子切換實(shí)驗(yàn)采用在正離子模式下完成一次全掃描，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)依賴 MS2 HCD 裂解。隨后轉(zhuǎn)換到負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描和數(shù)據(jù)依賴 MS2 HCD 裂解。自動(dòng)極性切換提供了不同但是互為補(bǔ)充的降解產(chǎn)物的裂解信息。這些獨(dú)特極性的碎片能幫助確認(rèn)結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果（圖 6）。

結(jié)論

本文研究了霉酚酸酯 API 在 pH 2.0、 3.5、 6.0 和 8.2 條件下的熱和過(guò)氧化氫降解。采用臺(tái)式高分辨率質(zhì)譜儀 Q Exactive Focus與 UHPLC 系統(tǒng)聯(lián)用快速準(zhǔn)確地分析了降解產(chǎn)物，見(jiàn)圖 1、 2 和 3。
● 高分辨率準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)測(cè)定（HRAM）的全掃描圖譜實(shí)現(xiàn)了快速的鑒定 – 獲得降解產(chǎn)物元素組成的關(guān)鍵信息。
● 信息量豐富的高能量碰撞解離（HCD）MS/MS 圖譜有利于準(zhǔn)確鑒定降解產(chǎn)物。
● 全掃描和 MS/MS 模式下的正 / 負(fù)離子切換模式能全面鑒定降解產(chǎn)物，如圖 4 和 5 所示。
● 數(shù)據(jù)分析軟件 Mass Frontier 極大的提高了降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析的速度和可靠性。
Q Exactive Focus 臺(tái)式 Orbitrap MS 具有強(qiáng)大的功能，在一體化UHPLC/HR-MS/MS 平臺(tái)上快速高效地完成降解產(chǎn)物分析，從而顯著提高了藥物研發(fā)過(guò)程中降解產(chǎn)物的鑒定通量。

參考文獻(xiàn)

1. M. Brandl, Degradation Products of Mycophenolate Mofetilein Aqueous Solution Drug Development and IndustrialPharmacy, 25 (3), 361-365 (1999)
2. FDA Guidance for Industry. Analytical Procedures andMethods Validation (draft guidance), August 2000.
3. ICH guidelines Q1A (R2). Stability Testing of New Drug Substances and Products (revision 2), November 2003.