聶愛英

賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司

 

Orbitrap Fusion；LTQ-Orbitrap系列質(zhì)譜；融合蛋白Enbrel；ETD-triggered CID；二硫鍵分析

 

融合蛋白 Enbrel (Etanercept) 是由人的腫瘤壞死因子（TNF，Tumornecrosis factor）膜外受體部分和人的免疫球蛋白（IgG1）的 Fc 部分融合而成，是一種人源 TNF-α 受體抗體融合蛋白，是腫瘤壞死因子（TNF-α）的拮抗劑，它通過抑制 TNF-α 可以起到控制炎癥、阻斷病情進(jìn)展的作用，它屬 DMARD 類藥物，可用于活動(dòng)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、牛皮癬及關(guān)節(jié)性牛皮癬、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、及活動(dòng)性強(qiáng)直性脊柱炎。

 

二硫鍵作為共價(jià)鍵交聯(lián)多肽鏈內(nèi)或鏈間的兩個(gè)半胱氨酸，對(duì)于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、維持正確的空間折疊構(gòu)象、保持及調(diào)節(jié)其生物活性等都起著舉足輕重的作用，尤其對(duì)于生物藥品，二硫鍵的位置和連接情況對(duì)于生物藥物的空間結(jié)構(gòu)、藥物活性等起著關(guān)鍵的作用。目前，常用的定位二硫鍵的方法主要分為X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)解析法、多維核磁共振法、二硫鍵異構(gòu)及突變分析法、酶解法和化學(xué)裂解法等，這些方法都各具特色，也各有局限性。隨著質(zhì)譜儀器在質(zhì)量檢測(cè)范圍、分辨率、靈敏度、準(zhǔn)確度和分析速度等方面的不斷發(fā)展，從而使得質(zhì)譜分析法更加適用于二硫鍵的定位分析中。目前，常用的質(zhì)譜碎裂技術(shù)，包括碰撞誘導(dǎo)解離（CID）、高能碰撞解離（HCD）和電子轉(zhuǎn)移解離（ETD）等都可以直接應(yīng)用到二硫鍵的碎裂分析中，不過不同的碎裂模式對(duì)于化學(xué)鍵的斷裂各有特點(diǎn)：ETD 更加易于肽段間的二硫鍵斷裂，而 CID 更加易于肽段中肽鍵的斷裂，因此將二者聯(lián)用起來，也就是 ETD-triggered CID 的方法，可以首先通過 ETD 打開肽段間的二硫鍵，得到二硫鍵的連接信息，然后采用 CID 將解離開的肽段分別進(jìn)行碎裂，從而得到肽段的氨基酸序列，這樣就可以在一次實(shí)驗(yàn)中，得到完整的二硫鍵的定位信息，如圖 1 所示。

 

目前，最新的 Orbitrap Fusion 和 LTQ-Orbitrap 系列的組合式質(zhì)譜儀都結(jié)合了最新的雙壓線性離子阱質(zhì)譜儀和新型高場(chǎng) Orbitrap^TM 質(zhì)量分析器，可以提供超高的分辨率、超高的靈敏度、快速的掃描速度和更大的動(dòng)態(tài)范圍，并且可以在同一臺(tái)質(zhì)譜上同時(shí)實(shí)現(xiàn)低分辨和高分辨掃描，從而都可以進(jìn)行以上的二硫鍵定位分析，為各種蛋白質(zhì)樣品，特別是各種生物藥產(chǎn)品，比如單抗、融合蛋白等提供了準(zhǔn)確、快速、可靠的分析測(cè)試方法與平臺(tái)。

 

圖 1. 應(yīng)用于二硫鍵定位分析的 ETD-triggered CID 實(shí)驗(yàn)示意圖（HR 表示高分辨掃描，LR 表示低分辨掃描）

 

質(zhì)譜儀器：Orbitrap Fusion（賽默飛世爾科技，美國(guó)）；

色譜儀器：Easy Nano1000液相色譜系統(tǒng)（賽默飛世爾科技，美國(guó)）；

色譜柱：自制反相色譜柱（C18，2 μm，75×150 μm，100 Å）；

試劑：色譜級(jí)甲酸、二次去離子水，色譜級(jí)乙腈。

 

2.2 儀器方法

色譜分析條件：具體見表 1；

質(zhì)譜分析條件：具體見表 2；

 

表 1. 融合蛋白二硫鍵分析的色譜條件

 

表 2. 融合蛋白二硫鍵分析的質(zhì)譜條件

 

使用 Proteome Discoverer 1.3 軟件對(duì)原始譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索，具體參數(shù)如下，流程圖如圖 2 所示：

數(shù)據(jù)庫：融合蛋白對(duì)應(yīng)的氨基酸序列；

一級(jí)質(zhì)量偏差：20 ppm；二級(jí)質(zhì)量偏差：0.02 Da；三級(jí)質(zhì)量偏差：0.8 Da；

酶：trypsin+Chymotryspin；

酶漏切位點(diǎn)：2；

 

圖 2. Proteome Discoverer 1.3 軟件對(duì) ETD-triggered CID 原始數(shù)據(jù)進(jìn)行二硫鍵定位分析的流程示意圖

 

a. 色譜質(zhì)譜提取流圖如下所示：

 

 

由上圖可以看出，該肽段對(duì)應(yīng)的一級(jí)母離子在 13.96 min 洗脫出來，相應(yīng)的質(zhì)量偏差在 5.4 ppm。

b. ETD 二級(jí)碎裂匹配圖

 

 

由上圖可以看到，二硫鍵連接的兩條肽段在經(jīng)過 ETD 碎裂后，不僅產(chǎn)生了相應(yīng)的兩條肽段的碎片離子，而且也同時(shí)產(chǎn)生了二硫鍵連接在一起的其它碎片離子信息。

 

c. CID 三級(jí)碎裂匹配圖

 

 

 

由上圖可以看到，ETD 碎裂產(chǎn)生的肽段 P1 和 P2 在后續(xù)的三級(jí) CID 碎裂中，產(chǎn)生大量的 b、y 碎片離子，可以有效的確定肽段 P1 和 P2 的組成，并且結(jié)合 ETD 的信息，從而確定肽段 P1 和 P2 之間通過二硫鍵被連接在一起。

 

a. 色譜質(zhì)譜提取流圖如下所示：

 

 

由上圖可以看出，該肽段對(duì)應(yīng)的一級(jí)母離子在 30.42 min 洗脫出來，相應(yīng)的質(zhì)量偏差在 0.4 ppm。

b. ETD 二級(jí)碎裂匹配圖

 

 

由于受到目前軟件的限制，對(duì)同一張 ETD 碎裂譜圖，我們根據(jù)不同的二硫鍵連接分別進(jìn)行了兩次碎片離子標(biāo)記，可以觀察到肽段 P1、肽段 P1-P2、肽段 P3 和肽段 P2-P3，如上所示。可以看到通過 ETD 碎裂，不僅產(chǎn)生了相應(yīng)的兩條肽段的碎片離子，而且也同時(shí)產(chǎn)生了二硫鍵連接在一起的其它碎片離子信息。

 

c. CID 三級(jí)碎裂匹配圖

 

 

由上圖可以看到，ETD 碎裂產(chǎn)生的肽段 P1 和 P3 在后續(xù)的三級(jí) CID 碎裂中，產(chǎn)生大量的 b、y 碎片離子，因此可以確定肽段 P1 和 P3 的存在。 從結(jié)果中發(fā)現(xiàn)肽段 P2 未被有效的鑒定，這可能是由于鏈間二硫鍵的存在或者是在二硫鍵碎裂的過程中，發(fā)生了其它化學(xué)鍵的碎裂或者連接所導(dǎo)致，不過通過以上的 ETD 和 CID 碎片信息，可以判斷這三條肽段之間確實(shí)存在兩對(duì)鏈間二硫鍵。

 

本文通過 Orbitrap-Fusion 質(zhì)譜建立了 ETD-triggered CID 的二硫鍵分析測(cè)試方法，并且在融合蛋白的樣品中進(jìn)行了實(shí)際樣品分析，由于酶切位點(diǎn)的局限性，目前采用胰酶和糜蛋白酶的酶解方法，可以準(zhǔn)確確定大部分存在的二硫鍵連接信息，同時(shí)還可以提供二硫鍵錯(cuò)配的信息，為單抗、融合蛋白等生物藥品的二硫鍵分析提供了有效的分析測(cè)試方法和平臺(tái)。除此之外，Orbitrap-Fusion 和 LTQ-Orbitrap 系列的組合式質(zhì)譜儀，憑借其超高的分辨率、超快的掃描速度和超高的質(zhì)量精度，并且結(jié)合靈活多樣的方法設(shè)置和多種碎裂方式，極大地完善和推動(dòng)了生物制藥行業(yè)的質(zhì)譜深入鑒定和定量分析。